RNA PULL DOWN 探针制备服务相关交流-蚂蚁淘在线

提供商：	Transheep，Shanghai
服务名称：	生物素标记RNA探针制备服务

lncRNA简介
长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的科研价值和意义。其中RNAPull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。

技术特点

RNA探针全链标记生物素，与末端标记的RNA探针相比亲和力更强。
配套的耗材与试剂，提供完整的RNApulldown解决方案。
在线技术支持。
提供配套的LncRNA载体构建方案及整体实验解决方案，如lncRNA过表达、干扰，稳转细胞系构建、ceRNA、动物实验等相关技术指导。

实验流程

载体构建
RNA探针制备
磁珠-RNA复合物孵育
蛋白提取
RNA-Pro孵育
洗脱
鉴定(SDS-PEGE银染，WB，MS）

DNA模板构建

目的LNCRNA到T7启动子载体，如pcDNA3.1+
选择合适的限制性内切酶线性化质粒，获得线性化DNA模板，
使用DNA产物回收试剂盒胶回收目的片段，RNA体外转染需要高浓度高纯度的DNA模板，浓度不够可以乙醇沉淀或者冷冻干燥浓缩。

RNA探针制备

使用T7体外转录试剂盒转录制备探针
普通RNA探针（对照用）

TranscriptionBuffer(5X)	10μl
NTPMixture(10mMeach)	10μl
线性DNA模板	1μg
RibonucleaseInhibitor	50U
T7RNAPolymerase	30U
补充经DEPC处理的去离子水	至50μl

BIOTIONRNA探针

TranscriptionBuffer(5X)	10μl
NTPMixture(10mMeachwithoutCTP) Bio-16-UTP(10mM)	10μl
线性DNA模板	1μg
RibonucleaseInhibitor	50U
T7RNAPolymerase	30U
补充经DEPC处理的去离子水	至50μl

反应：设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体，孵育1~2个小时。
消化：加入2ulDNaseI37ºC孵育1小时，消化DNA模板。
终止：取出操作的EP管，加入2µl0.2M EDTA(pH=8.0)终止反应，然后将RNA95℃加热2min，室温静置30min，加入RibonucleaseInhibitor 2ul冰浴保存。
鉴定：电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率。

磁珠-RNA复合物孵育

预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭含链霉亲和素的磁珠。
RIPWashBuffer冲洗3次磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。
过夜的混合物磁珠分离1min，去上清。
RIPWashBuffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。

蛋白裂解（核浆分离）

准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万HeLa细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)
5.最高速剧烈Vortex5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)
6.冰浴10-15分钟。
7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。
8.最高速剧烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。
9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。)
10.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)
11.最高速剧烈Vortex15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。
12.4℃12,000-16,000g离心10分钟。
13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。每200万细胞用50微升本产品中的细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清，其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml，不同细胞有所不同。
14. 对于新鲜组织：
a.把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品，仅需加入100微升组织匀浆液)，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
b.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。
c.4℃1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)
d.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白(特别说明：对于起始量为30-60mg的组织样品，后续直接按照步骤4-13操作即可；对于起始量不超过30mg的组织样品，后续步骤4-13中的溶液的用量须减半使用)。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为3-10mg/ml，细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

RNA-PRO复合物孵育

珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。
将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物磁力离心，使用RIPWashBuffer冲洗3次，1次1ml。
SDS-PEGA 银染鉴定

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