自从1993年在线虫中发现了第一个miRNAlin-4，过去的20年里miRNA的研究一直非常火热，从单一的研究到与其他组学结合，套路一直未变，胞浆miRNA可降解靶基因或抑制其翻译。随着研究的增多，miRNA抑制机制的研究似乎已到了瓶颈期，名气也被新发现的lncRNA，circRNA比了下去。但是“柳暗花明又一村”，去年2月份复旦大学于文强课题组发表在RNABiology上的一篇miRNA激活机制的文章，揭示了核内miRNA可通过结合增强子，改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达[1]。今年的3月份诺贝尔奖得主PhillipSharp在Cell上发表的文章，研究结果进一步印证了miRNA激活理论[2]。也就是说miRNA具有双重功能，当位于胞浆时可抑制基因表达；当位于细胞核内可激活基因的转录。今天就先解读一下于教授的这篇文章，希望能为大家提供新的miRNA研究思路~

摘要

miRNA是一种小非编码RNA分子，对基因的表达有负调控作用。最新研究显示miRNA除了位于胞浆，还存在于细胞核内，然而核内miRNA的作用机制目前还不了解。通过筛选miRNA数据库，作者找到许多作为增强子调节器的miRNA，其中的一些可激活基因表达。以miR-24-1为例，可以与增强子结合激活基因转录，但是当这个增强子序列被TALEN删除后激活作用会终止。而且作者发现miR-24-1可激活增强子RNA（eRNA）的表达，改变组蛋白修饰，提高p300及RNAPolII在增强子区域的富集。

研究思路

>miRNA筛选

从miRBase库中筛选位于增强子区域的人类miRNA，而且该区域要有H3K27ac富集。

>miRNA定位

FISH对挑选的miRNA进行定位，倾向于位于核内。

>miRNA过表达/敲低

通过miRNA敲低/过表达检测邻近基因（400bk以内）的表达水平，发现miRNA过表达时会提高邻近基因的表达，反之会降低邻近基因的表达。

>增强子区域的完整度影响miRNA行使功能

利用TALE技术删除增强子序列，验证邻近基因表达水平，发现当增强子不完整时,miRNA无法激活基因转录。

>增强子区域染色质状态的改变

将miRNA过表达后会招募RNAPolII，P300/CBP,AGO2,使组蛋白修饰H3K27ac水平增加，H3K4me1水平降低，导致染色质状态发生改变，促进基因转录。

>miRNA可以结合和激活靶标增强子

miRanda预测显示活性增强子区域有miRNA的靶结合位点，miRNA结合并激活靶标增强子，从而促进邻近基因转录。

研究结果

1.从miRBase库中筛选位于增强子区域的人类miRNA

作者在7种不同的组织细胞中，对1594条miRNA前体进行了分析，发现有300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志H3K27ac富集区域高度重叠(Fig.1A）。以GM12878细胞系为例，发现H3K4me1,p300/CBP,DNase-I-hypersensitivesites富集区域与miRNA位置也重叠，与H3K27ac模式相似(Fig.1B）。以上证据表明miRNA与增强子有关。另外，作者还发现位于H3K27ac富集区域的miRNA倾向于存在细胞核内，核内miRNA与邻近基因的表达呈正相关(Fig.1B）。

Figure1|Classificationandcharacterizationofenhancer-associatedmiRNAs.

2.增强子区域的miRNA具有转录激活功能

作者推测在增强子区域的miRNA与在启动子区的miRNA功能类似，可调节邻近基因的表达。为了验证该假设，作者选择miR-26a-1，其400kb以内的基因包括ITGA9,CTDSPL,VILL，PLCD1。将miR-26a-1过表达后，ITGA9和VILL表达量明显增加,为了进一步证明，又将miR-339过表达，发现邻近的基因GPER表达量增加了4倍(Fig.2A）。

接着又对miR-3179，miR-3180进行分析，两个分子均位于NOMO和PKD1P1的间区，但H3K27ac富集水平显著不同(Fig.2B）。首先，萤光素酶报告实验显示含有miR-3179的DNA片段具有增强子活性，而含有miR-3180的不具有增强子活性，显示H3K27ac富集是潜在增强子的可靠标记。将miR-3179转染到细胞系，发现邻近基因ABCC6（3倍）、PKD1P1（5倍）显著上调。而转染miR-3180后邻近基因没有变化(Fig.2B），显示miRNA的激活功能与增强子活性及组蛋白修饰水平有关。

为了进一步研究miRNA功能，作者选择miR-24-1（chromosome9），miR-24-2（chromosome19），二者成熟序列完全相同，但前体来自于不同的染色体，邻近基因不同，结果显示miR-24-1，miR-24-2都可以激活它们的邻近基因。另外，Northernblotting显示，当pre-miR-24过表达后，成熟体miR-24同时存在于细胞质与细胞核内，说明pre-miRNA的转染不仅增加胞浆内的miRNA表达，还能增加核内miRNA表达。继续以miR-24-1为对象进行研究，检测邻近基因FBP1，FANCC的蛋白水平，结果显示增加(Fig.2C)。同时，胞浆内的miR-24-1靶基因下调，显示miRNA在胞浆内正常发挥抑制作用。

前面都是将miRNA前体转染到细胞系中，为了证明miRNA成熟体的作用，将miR-24mimics，miR-3179mimics分别转染到细胞，发现可以提高邻近基因的表达水平（Fig.2D）。又做了miR-24的敲低实验，qPCR显示邻近基因表达明显下调（Fig.2E）。

Figure2|EnhancerassociatedmiRNAmediatestranscriptionalgeneactivation.

3.miR-24-1促进基因转录需要依赖完整的增强子

在miR-24-1种子区域进行删除或突变处理，发现miRNA诱导的转录激活作用终止(Fig.3A,B)。利用TALE技术删除miR-24-1所在的增强子区域(Fig.3C)，增强子区域被破坏，miRNA表达明显下降。在TALEN删除的细胞中，即使在miR-24-1过表达的条件下，miR-24-1邻近基因也不能被激活(Fig.3D,E)，然而miR-24-2的邻近基因表达水平上调。以上结果表明miRNA对邻近基因的转录激活需要依赖完整的增强子。

Figure3|miRNAmediatedtranscriptionalgeneactivationrequirestheintactmiRNAanditstargetedenhancer.

4.miR-24-1需要通过提高内源miRNA表达及增强子染色质状态的改变来行使功能

通过染色实验发现miR-24-1确实可以进入核内。为了确定内源miRNA是否参与miRNA的功能，将miR-24-1mimics转染后发现miR-24-1前体水平显著增加，说明在有活性的增强子区域，外源miRNA能够增加内源miR-24的表达(Fig.4A）。先前报道称AGO2在核内也存在并发挥作用，作者将AGO2敲低，miR-24-1邻近基因表达水平显著下调，说明AGO2可能对于miR-24的活性有影响（Figure4B）。另外也有报道增强子活化与RNA聚合酶II有关，本文结果显示当miR-24-1过表达后，RNAPII，AGO2，p300/CBP在miR-24-1增强子区域富集，而且将miR-24-1,miR-26a-1,miR-339,miR-3179分别转染到细胞后，活性增强子产生的eRNA含量增加(Fig.4D）。同时，活性增强子标记H3K27ac增加，抑制标记降低，NOMe-Seq结果显示在miR-24-1增强子区域和FBP1启动子区的蛋白位置发生明显改变(Fig.4E）。以上结果表明miR-24-1过表达后会导致内源miR-24表达量增加，增强子的染色质状态发生改变，参与基因的激活。

Figure4|EpigeneticeventsinvolvedinmiRNAs’transcriptionalactivation.

5.miR-24-1通过结合和激活靶标增强子促进大量基因的转录

基因芯片数据显示miR-24-1过表达可以上调一些基因的表达，也可以下调另一些基因的表达(Fig.5A)。miRanda分析显示下调的基因3’UTR与miR-24-1有更多的潜在结合位点，表明miRNA通常在细胞质内行使功能。作者通过ChIP-seq分析显示，miR-24-1过表达的细胞内，活性增强子标记H3K27ac显著富集在3282个增强子区域，并且在这些区域找到了与miR-24-3p种子序列相似的motif，重要的是3282个增强子中有60.42%的区域被miRanda预测为miR-24-1的靶位点(Fig.5B)。另外，上调的基因倾向于位于活性增强子两侧(Fig.5C)，比如在miR-24-1过表达的细胞中，miR-24-1的靶向增强子上H3K27ac,H3K4me1，PolⅡ显著富集，H3K9me3富集减少(Fig.5D)，从而促使KDM6B基因上调。另外还发现miR-24-1也能激活远端基因-DUSP16，ENO3的转录。为了进一步证明增强子完整度的重要性，利用TALEN删除miR-24-1的靶向增强子序列，导致邻近基因KDM6B,LSMD1,CYB5D1上调终止，即使miR-24-1过表达也于事无补。

Figure5|miRNAsmayactivategenome-widegenetranscription.

总结：从本文来看，miRNA核内激活机制的基本思路是核内miRNA可与增强子结合，招募RNAPolII，P300/CBP,AGO2到增强子区域,使组蛋白修饰H3K27ac水平增加，H3K4me1水平降低，导致染色质状态发生改变，增强子活化，从而促进miRNA邻近基因转录。

参考文献：

[1]MinXiao,JinLi,WeiLi,YuWang,FeizhenWu,YanpingXi,LanZhang,ChaoDing,HuaibingLuo,YanLi,LinaPeng,LipingZhao,ShaoliangPeng,YaoXiao,ShihuaDong,JieCao&WenqiangYu(2016):MicroRNAsActivateGeneTranscriptionEpigeneticallyasanEnhancerTrigger,RNABiology,DOI:10.1080/15476286.2015.1112487

[2]HiroshiI.Suzuki,RichardA.Young,PhillipA.Sharp.(2017):Super-Enhancer-MediatedRNAProcessingRevealedbyIntegrativeMicroRNANetworkAnalysis,Cell168,1000–1014.