1)从杂交过的小鼠胚或鸡胚或器官样本移除杂交溶液并加入800μL预杂交溶液A，7℃洗5min。

2)不要移除预杂交溶液，向试管中再加入400μL2×SSC,pH4.5溶液，70℃洗5min,重复加2×SSC2次，并再洗2次。

3)移去混合液，并在0.1%CHAPS/2×SSC中70℃洗两次，每次洗30min。

4)用含有20μg/mlRNA酶A的0.1%(V/V)CHAPS/2×SSC溶液37℃消化1h。

5)先用MAB室温下洗样本两次，每次10min,再在70℃用MAB洗2次，每次30min。

6)PBS室温下洗样本两次，每次10min。

7)PBT室温下洗5min。

8)室温下用封闭液封闭样本2〜3h。

9)移去封闭液，加入2ml预吸附处理的连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体Fab片段。4℃下轻摇过夜。

10)移除溶液并加入0.1%(m/V)BSA/PBT溶液，将样本转移到20ml的带咬合盖玻璃小瓶中，用0.1%(m/V)BSA/PBT溶液室温下洗5次，每次45min并轻轻摇晃。

11)用PBT溶液洗2次，每次30min。

12)NTMT缓冲液洗3次，每次10min。

如果使用BoehringerMannheim公司的BM紫AP底物溶液则只需洗2次。

13)将样本完全浸没于3mlNBT/BCIP显色溶液或者BM紫AP底物溶液中孵育。用锡箔包住小瓶轻轻摇晃20min开始显色。

14)用肉眼或者用解剖镜观察染色情况。当信号达到希望的水平时（20min〜48h),用PBT至少洗6次以停止显色反应。

显色的样本能够在4℃下含有100mmol/LEDTA的PBT中保存2〜3个月而不影响信号强度。

15)可选：在4%PFA/PBT中4℃固定样本过夜。用PBT洗样本数次然后在PBT中4℃存储。

16)样本放在PBT溶液中在皮氏培养皿拍照。