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Western Blot Protocol
一、提取抗原蛋白 将提取RNA途中留存的样品,加入150μl100%酒精充分混匀,静置5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),12000×g,4℃离心10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀,用50℃热水助溶,直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。 二、蛋白定量 1.取PBS、各样品10ul,加DW990ul 2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml。 3.向各管加入2.5mlD试剂(A50ml+B0.5ml+C0.5mlA-2%[陈星云1][陈星云1]Na2CO3、0.1NNaOH,B-0.5%CuSO4,C-1%酒石酸钠)混匀,静置10分钟。 4.迅速加入酚试剂0.25ml,混匀37℃水浴30分钟。 5.721分光光度计650nm,比色,S0标准管调零。 6.最后稀释为4ug/ul,加载样缓冲液后,终浓度为2ug/ul,上样量为30~80ug/泳道。 三、电泳 1.makegel. 11%分离胶12ml两块胶 4%积层胶6ml两块胶 DW4.36ml DW堵漏3.66ml 3MTris3.0ml 0.5MTris1.5ml 30%Arc4.4ml 30%Arc0.5ml0.78ml 10%SDS0.24ml 10%SDS60ul 10%APS0.12ml 10%APS20ul30ul TEMED10ul TEMED5ul6ul 2.上样前样品处理: 样品100℃、3分钟、冷却,900×g、离心30S。 3.通电电:积层胶电泳电压50V左右,分离胶电泳电压90~110V。 4.考马斯亮蓝染色:1小时,1号脱色1小时,2号脱色2小时。 四、电转印 1.将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小,置于DM中浸透5分钟,电转液平衡15分钟。 2.转移:用二张大滤纸贴于两张多孔垫料,将NcM、胶夹于中间,在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极,20V恒压转移12小时。取下NcM杂交,凝胶染色看效果。 五、杂交 1.取下NcM,做好标记,dH2O冲洗,室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。 2.NcM用PBS冲洗二遍,呈5~6%non-fatmilk的pH7.2的PBS中封闭,室温6-8小时或室温1-2小时,4℃,过夜。 3.将封闭的膜用PBS冲洗一遍,洗15分钟×1,5分钟×2。 4.加入一抗1:1000-1200,室温,反应1小时 5.PBS洗15分钟×1,15分钟×4。 6.加入二抗1:5000,室温,反应1小时。 7.PBS洗15分钟×1,5分钟×4。 六、化学发光试剂检测 1.混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。 2.放射自显影:曝光3分钟至10分钟。 3.显影后清水漂洗,再定影。 七、所用试剂 1、匀浆缓冲液4×1L: NaH2PO4(·H2O) 12.48g Na2PO4·12H2O 114.6g NaCl 3.6g dw800ml,adjustpHto7.0,adjustVolto1L (1)用时稀释4倍。 (2)40mlPBS+PMSF40ul+1.10phenautehroline80ul+Iodo80ul+pepstalmA80ul 2.系列牛血清蛋白浓度稀释法: 取500ug/mlBSA按下法配制: 500ug/mlBSA NS 蛋白浓度ug/ml S1 50ul 1.95ml 12.5 S2 100ul 1.90ml 25 S3 200ul 1.80ml 50 S4 400ul 1.60ml 100 S5 800ul 1.20ml 200 3.30%Acrylamide 29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60mlDDW,调Vol到100ml 4.3MTris-HclbufferpH8.9100ml. 称Tris36.3g溶于水到100ml,调pH到8.9 5.0.5MTris-HclbufferpH6.7100ml 称Tris5.98g溶解后,调pH到6.7,调体积到100ml 6.Samplesbuffer10ml 10%SDS 2ml 甘油 1ml 0.5MTris 1.6ml 用前按9:0.5:加0.1溴酚兰、0.5%DTT贮备液。 DDW 5.2ml 7.电转液1LpH8.2-8.3 Glycine 14.42g Trisbase 3.02g dH2O 800ml Methanol 200ml 10%SDS 2ml 8.pH7.2PBS2L NaCl 18.0g KCl 0.44g Na2HPO4 2.84g(7.16g) NaH2PO4 0.432g(0.562g) 加DW到2L 9.10×电极缓冲液400mlpH8.4 Trisbase 12.2g 甘氨酸 57.76g 加DW400ml,调pH8.4,用前加SDS0.1% 10.脱色液1号 甲醇 250ml 冰醋酸 50ml +DW到500ml 11.脱色液2号 甲醇 100ml 冰醋酸 75ml +DW到1000ml
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