常用转染试剂的操作说明（中文）

FuGENE6（Promega）转染步骤:

转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1、在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。

2、将3-6ulFuGENE6Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3、加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。

4、室温孵育20分钟。

5、将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。

6、将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7、3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：

1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEMI培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。

3、使用前将Lipofectamine2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEMI培养基）稀释10ulLipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4、混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine2000（第三步）。室温放置20分钟。

5、（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2ml无血清配养基。

6、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

7、在37℃，5％CO2中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。

或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。

8、在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。

Lipofectamine2000转染试剂转染步骤（24孔板）：

1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数（0.5-2×105），细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、对于每孔细胞，使用50ul无血清培养基（如OPTI-MEMI培养基）稀释0.8-1.0ugDNA，轻轻混匀。

3、使用前将Lipofectamine2000转染试剂轻轻混匀，用50ul无血清培养基（如OPTI-MEMI培养基）稀释1-3ulLipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4、混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine2000（第三步）。室温放置20分钟。

5、（optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入0.5ml无血清配养基。

6、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

7、在37℃，5％CO2中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。

或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。

8、在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

贴壁细胞的稳定转染：转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。

EffecteneTransfectionReagent(Qiagen)转染步骤：

以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每6孔培养板使用0.4ugDNA。尽管DNA的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

1、转染前一天，用5ml含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。

2、在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO2）。转染当天细胞应40-80％融合。

3、转染时，用DNA浓缩缓冲液（ECBuffer）稀释1ugDNA至100ul总体积（DNA用pH7-8的TEBuffer溶解，DNA最低浓度：0.1ug/ul）。加入3.2ulEnhancer，涡旋1s以混合溶液。

重要：请保持DNA与Enhancer比例恒定。

注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGENPlasmidKits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用EndofreePlasmidKit，该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染结果。

4、室温（15-25℃）孵育2-5分钟，离心（spindown）几秒钟以从管顶去除液滴。

5、向DNA-Enhance混合液中加入10ulEffecteneTransfectionReagent，反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。

注意：没必要一直把EffecteneReagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。

6、室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。

7、孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用4mlPBS洗涤一次细胞。加入1.6ml新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。

8、加入0.6ml培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物drop-wise加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。

9、将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。

Optional:大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后6-18小时移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗涤一次细胞，然后加入5ml新鲜细胞培养液。

10、瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。

转染β-gal或cat报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达最大化。

稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:5~1:10传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液。

SuperfectTransfectionReagent(Qiagen)转染步骤：

以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

１、转染前一天，用含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。

２、在细胞的正常培养条件下培养（通常37℃和5％CO2）。转染当天细胞应40-80％融合。

3、转染时，用无血清培养基稀释2ugDNA至100ul总体积（DNA用pH7-8的TEBuffer溶解，DNA最低浓度：0.1ug/ul）。混合，离心几秒钟以从管顶去除液滴。

注意：质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGENPlasmidKits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得最好的重复性和最好的结果，我们推荐使用EndofreePlasmidKit，该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素，从而获得最佳的转染结果。

4、向DNA稀释液中加入10ulSuperfectTransfectionReagent，反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。

注意：没必要一直把SuperfectReagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。

5、室温下（15-25℃）孵育5-10分钟以形成转染复合物。

6、孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用2mlPBS洗涤一次细胞。

7、加入600ul培养液（包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的EP管中。吹打两次以混合，立即将转染复合物加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。

8、将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育2-3小时。

9、小心移除Superfect-DNA混合物，用2mlPBS洗涤3-4次细胞

10、加入新鲜的正常培养基，孵育24-48小时。

11、瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。

转染β-gal或cat报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达最大化。

稳定转染时，在转染后24-48小时，将细胞以1:10~1:15传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量-反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育1-2天，然后再加入选择性培养液。