分子酶专栏之等温扩增酶与原核DNA聚合酶

一．经典的原核DNA聚合酶

在细菌中，三种DNA聚合酶PolI、PolII、PolIII共同作用，实现DNA的复制。这三种酶具有相同的5’-3’的延伸活性，只是延伸的速率不同。同时它们都具有3’-5’方向的核酸外切酶活性，这保证了DNA复制过程中的保真性，也就是所谓的矫正活性（proofreADIng）。除此之外，DNAPolI还具有5’-3’方向的核酸外切酶活性。这个活性很重要，它可以在CDNA第二链合成过程中去除RNA引物，还可以进行DNA链的切除修复（excision-repair）。

DNA聚合酶IandKlenow片段

野生型DNAPolI常被用来去除3’突出末端或补齐带有5’突出端的双链DNA。不过，它的5’-3’外切酶活性使其并不适用于所有的“DNA聚合酶”场景，比如需要在连接额外的linker后，才能进行3’凹末端的补齐，不然突出的5’端会被切掉；而且它也不适合双脱氧测序过程中的单链DNA扩增。不过好在，人们很早之前就发现，蛋白水解酶消化DNAPolI可以得到两个独立的片段，分子量分别为76和36kDa。其中大片段就是我们熟悉的Klenow片段，保留DNA聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性，小片段只有5’-3’外切酶活性。由此可见，单纯的Klenow片段显然更具有应用价值，当然现在的商用Klenow片段都是大肠杆菌重组表达的产物，不然的话，用蛋白水解方式得到的Klenow免不了污染小片段。

T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶需要在模板和引物存在条件下发挥两种活性：当反应体系中不含或dNTP不足时，表现出强烈的3’-5’外切酶活性；当dNTP存在时，表现正常的5’-3’DNA聚合酶活性。不像大肠杆菌DNAPolI，T4DNA聚合酶没有5’-3’方向外切酶活性，所以可以大胆地用于5’突出末端的双链DNA的补齐，制备平末端产物。对于双链的DNA，T4Pol的外切酶效率大约为40bp/min，而对于单链DNA，它的切割活性达到惊人的4000bp/min。不过，更令人吃惊的是，在标准反应体系中，它的DNA聚合速度可达15000bp/min，这已经比任何的PCR酶都快了。不过，考虑到T4DNAPol具有矫正活性，这个合成速度实在令人匪夷所思。

二．等温扩增酶

PCR技术是上世纪最伟大的发明之一，它的出现极大地满足了人们日益增长的核酸扩增需求。而作为PCR的有益补充，等温扩增技术自从上世纪末出现以来越来越受到大家的重视，主要应用于微量的全基因组扩增和检测应用。大多数的等温扩增需要用到具有强烈链置换能力的DNA聚合酶，这些酶可以在复制的时候置换下游的DNA链从而不需要模板变性。常见的具有链置换能力的DNA聚合酶有A家族的BstDNA聚合酶以及来自B家族的phi29，前者最经典的应用是“环节到等温扩增”技术（图1），后者被广泛地用于微量模板扩增的“滚环扩增技术”（图2）。Phi29作为B家族成员，显著的特点是具有扩增矫正活性，但同时扩增效率就比Bst要差，不过根据最新报告，有人将phi29与Sso7d之类的DNA双链结合蛋白相融合，可极大地提升扩增能力。

相比于phi29，Bst的应用开发比较早，商业化的Bst通常是其大片段产物，活性比全长的蛋白高。Phi29完全不耐热，最适反应温度是30℃左右，Bst酶可耐热到75℃，最适反应温度是65℃。

图1.LAMP反应原理示意图

图2.基于滚环扩增的微量DNA等温扩增过程

三．DNA聚合酶与测序技术漫谈

DNA聚合酶的发展和应用，从一开始就与DNA测序技术息息相关，主要原因是目前所有的测序技术归根到底还是利用DNA聚合酶这一分子机器，在DNA扩增过程中记录延伸的dNTP种类。Sanger发明的第一代DNA测序技术——双脱氧核苷酸测序技术，最初使用的是Klenow片段，但是这个酶对双脱氧核苷酸的掺入效率比较低，后期有人基于T7DNA聚合酶进行改造，得到对双脱氧核苷酸不敏感的突变体，并开发成商业化的测序酶Sequenase2.0^TM。目前最新的Sanger法测序酶是基于Taq酶的突变体ThermoSequenase^TM和基于高保真酶9°N的突变体Therminator^TM。

在二代测序平台中，测序所用的dNTP多为修饰的、带有长链和荧光基团的dNTP类似物，这就对DNA聚合酶提出了更高的要求。比如一种9°NDNA聚合酶的突变体，在其掌域和手指域靠近活性位点区域具有多个特异性的点突变，这些突变可以改善9°N聚合酶的dNTP类似物的掺入。其他的NGS平台，如Thermo的IonTorrent和罗氏的454平台开发了使用天然dNTP和野生型BstDNA聚合酶的技术，使用Bst的一个优点是可以利用它的链置换能力，突破复杂二级结构的扩增。

近几年开始受到广泛的关注的三代测序，是一种能够进行长片段测序的技术，目前最长的reads可至惊人的40kb，特别适用于具有广泛重复序列的植物基因组测序。三代测序平台不多，最有名的是PacificBiosciences公司的RS、RSII平台，以及最新款Sequel平台。目前这些平台测序工作还是需要用到聚合酶，既然它能测这么长的序列，所用的聚合酶必然需要能够扩增超长片段这一技能。PacBio使用的聚合酶就是经过突变，去除了核酸外切酶活性的phi29。当然，为了进一步增强其持续扩增能力，还可以将此phi29突变体融合一个双链结构蛋白。另外一个方案是突变9°NDNA聚合酶并添加一个人工“钳”来稳定其余DNA双链的稳定。不过我个人更看好对phi29的改造，因为其具有链置换能力，对复杂模板的扩增还是有一定优势的。

至此，分为三个篇章来讲述的DNA聚合酶专栏告一段落。限于篇幅，其实还有很多有意思的DNA聚合酶相关的知识点我们没有涉及，比如另一个重要的商业化高保真聚合酶系列Vent^TM与DeepVent^TM、优化PCR过程的添加剂选择等。关于这些，大家可以从文后附带的文献找到更多的你感兴趣的点。

参考文献：

1.Terpe,Kay.OverviewofthermostableDNApolymerasesforclassicalPCRapplications:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems.ApplMicrobiolBiotechnol(2013)97:10243-10254.

2.Sharma,Ritu.,etc.AnovelmethodforwholebloodPCRwithoutpretreatment.Gene(2012)501:85-88.

3.Aschenbrenner,Joos.,etc.DNApolymerasesandbiotechnologicalapplications.CurrOpinBiotechnol(2017)48:187-195

4.Shanbhag,Vinit.,etc.FamilyAandBDNAPolymerasesinCancer:OpportunitiesforTherapeuticInterventions.BIOLOG(2018)7(1):1-16.

5.ModifiedDNApolymerasesforPCRtroubleshooting.Microbialgenetics(2017)58:133-142.

6.Pan,Wenjing.,ect.DNApolymerasepreferencedeterminesPCRprimingefficiency.BMCBiotechnology(2014)14:10.