材料

缓冲液和溶液

试剂、缓冲液，储液的组成参见附录1,储液使用前稀释到适当浓度。

dATP(0.1mmol/L)
可选，参见步骤4。

去离子蒸馏水

EDTA(10mmol/L,pH8.0)

延伸/终止混合液和示踪混合液
这些反应混合液可通过混合dNTP和ddNTP储液制备，参见表12-7。

甲酰胺上样缓冲液

TM缓冲液
100mmol/LTris-Cl(pH8.5)
50mmol/LMgCl2

Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)

酶和缓冲液

大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKienow片段（5u/ul)
每一套四种双脱氧测序反应大约需2.5单位酶。Klenow片段通常保存在含50%甘油的缓冲液中。测序反应中过量使用酶会导致测序凝胶畸变，因为甘油与制备凝胶和凝胶电泳的标准缓冲液TBE中的硼酸盐离子相互作用（请参见本方案末尾疑难解答）。

核酸和寡聚核苷酸

dNTP、ddNTP、dNTP(1mmol/L)和ddNTP(5mmol/L)储液

寡核苷酸引物
浓度约为0.5pmol/ul(约3.3ng/ul),溶于水中。
对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物，可参见第8章信息栏“通用引物”及本章末信息栏“DNA测序寡核苷酸引物储液制备"。

单链DNA模板
浓度约0.05pmol/ul,相当于约0.15ug/ul的M13噬菌体单链DNA。
小规模制备M13噬菌体重组子单链DNA的浓度一般在0.05到0.5ug/ml范围内。这取决于特定噬菌体的生校速度。在正常的测序反应条件下，模板DNA是过量的。因而每次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末疑难答。

放射性化合物
[a-³²P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)或
[a-³³P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)或
[a-³⁵S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml)或
5"³²P标记的寒核苷酸引物

若不用放射性标记dATf作为内标记，也可以用5’端以³²P标记的寡核苷酸引物进行测序反应。此时，可用2ul(约5x10⁵cpm约0.5ng）放射性标记引物和2ul水代替反应中的未标记引物和[³²P]dATP(步骤4),其他的步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-³²P]转移至寡核苷酸5"端。详细情況见第10章的方案2。

离心机和转头

离心转头或用于0.5ml微量离心管的衔接头，以及甩平式转头和微量滴定板架(如Sorvall公司产品），聚苯乙烯泡沫或橡胶衬垫。

专用设备

微量离心管（0.5ml)或微量滴定板（柔韧，耐热，每孔容量为300ul的U型底96孔扳）。

参见信息栏"微量滴定板"

方法

1.在0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入：

单链模板DNA(0.1ug/ul)                                           5ul
寡核苷酸引物（1ug/ml,约160pmol/m])                   4ul
TM缓冲液                                                                1ul

2.封闭试管的顶端或密封微量滴定板，在55°C温育反应混合液5~10min,使寡聚核苷酸引物与DNA模板退火。若有必要，退火的模板和引物可在-20°C下保藏几个月。

3.用字母C、T、A、G标记四个微量心管或96孔U型微量滴定板上四个毗连的小孔;然后在每个小管中加入4ul相应的ddNTP延伸/终止混合液（例如在标记C的微量离心管或微量滴定板孔中加入4ulddCTP混合液，在标记T的微量离心管或微量滴定板孔中加入4ulddTTP混合液等)。

4.把退火后的引物模板溶液放在冰上并加入：

[α-32P]dATP或[α-33P]dATP或[α-35S]dATP                    1ul
Klenow酶（约2.5单位）                                                  1ul
0~1mmol/LdATP(如使用[α-32P]或[α-33P])                     1ul
或
水（如使用[α-35S]dATP)                                                  1ul

Klenow酶应储存在不要使其升到室温。酶在冰桶中几小时会丧失活性。

5.取步骤4的混合液3ul加到每一个C、T、A、G管的管壁上或微量滴定板孔的边上。不要让放射性标记混合液与ddNTP延伸/终止混合液接触。加入的液体应挂在管或孔靠近边缘的壁上。

6.把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或适合0.5ml离心管的衔接头，或把它们放入去盖的1.5ml离心管中），或者把微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机中，以2000r/min转速离心C、T、A和G各管或滴定板几秒钟，混合反应物。开始延伸/终止反应。37°C温育10~12min。
在室温至37°C温度范围内.Klenow酶都能很好地催化延伸/终止反应和示踪反应。

7.溫育后，沿每一个C、T、A、G管或孔壁加入1ul的示踪液。总共温育10~12min后，离心2s,使示踪液混入到延伸/终止反应液中。再在室温下温育10~12min。

8.第二次温育9~11min后，沿每一个C、T、A、G管或孔壁加入6ul甲酰胺上样缓冲液。不要让溶液滑入聚合反应液中。温育结束，离心微量离心管或微量滴定板终止测序反应。

9.反应物在-20°C时可最多保存5天，也可以用变凝胶电泳直接分析见方案8、9或10、11和12)。热变性后（100°C,2min),在冰上快速冷却。取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶各孔中。