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质粒DNA大量制备实验一平衡离心法
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| 实验方法原理 | 这种方法可以得到除去了大多数杂质的高纯度质粒DNA。但它需要使用溴化乙锭，并且需要长时间的超速离心来形成密度梯度。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA |
| 试剂、试剂盒 | TE氯化铯溴化乙锭NaCl乙醇 |
| 仪器、耗材 | 离心机平衡住 |
| 实验步骤 | 1. 粗裂解物制备方案最后一步得到的沉淀溶于4mlTE缓冲液中，加入4.4gCsCl，溶解后，再加入0.4ml10mg/ml溴化乙锭。 2. 将溶液转入一个5ml的quick-seal快速封口的超离心管中。 3. 酌情往管中加入CsCl/TE溶液，封好离心管。 4. 于20℃，500000g离心3.5h或于20℃，以350000g离心14h以上。 5. 首先从管的顶端描入一支针头，然后用带另一20G针头的3ml注射器将质粒带吸出。 6. 进行第二次超速离心，除去混杂的RNA和染色体DNA以获得更高纯度的质粒。 7. 按质粒溶液的1.5~2倍体积装DowexAG50W-X8柱子，用数倍体积的TE/0.2mlNaCl溶液清洙和平衡柱子。 8. 用注射器将混合有溴化乙锭的质粒DNA溶液直接加到树脂的顶部，注意不要摇动树脂。 9. 立即收集流出液，然后用2倍于上样体积的TE/0.2mlNaCl溶液洗脱柱子两次。 10. 加入2倍体积乙醇于室温或-20℃沉淀质粒DNA，于4℃，以10000g离心10min。 11. 沉淀用70%乙醉洗涤1遍，真空干燥，溶解于TE缓冲液，并于4℃保存。 |
| 注意事项 |