实验技术简介：Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

实验技术原理：
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferaseassay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

 

实验操作流程：
1、用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
2、设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
3、筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
4、扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
5、培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
6、将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
7、提取蛋白并用于荧光素酶检测。
8、加入底物，测定荧光素酶的活性。
9、计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

 

实验注意事项：
客户提供：
1、启动子活性分析：基因名称及ID；
2、转录调控：转录因子名称及ID、靶基因名称及ID；
3、miRNA靶基因验证：miRNA名称、物种信息、靶基因名称及ID；
 交付标准：
1、启动子活性分析：报告基因载体（启动子不同截断形式）；实验报告（引物设计、载体测序文件、酶活检测）；
2、转录调控：报告基因载体（野生型、突变型）；转录因子表达载体；实验报告（引物设计、载体测序文件、酶活检测）；
3、miRNA靶基因验证：miRNA靶基因结合位点；报告基因野生型载体、突变型载体；实验报告（引物设计、载体测序文件、酶活检测）；

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