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从琼脂糖凝胶(Agaros gel)中回收DNA片段
实验原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后,按分子量大小被分开,排列在琼脂糖凝胶中,可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来,加热或用特殊的试剂熔解凝胶,使DNA溶回到溶液中,再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。
实验试剂
2.荧光染料
3.电泳级琼脂糖粉
4.10′加样缓冲液
5.DNA分子量标准(DL2000)
6.DNA凝胶回收试剂盒
实验设备
1.旋涡混合器
2.微量移液取样器
3.移液器吸头
4.1.5ml微量离心管
5.双面微量离心管架
6.台式离心机
7.琼脂糖凝胶电泳系统
8.微波炉
9.恒温水浴
实验步骤
1.配制TAE电泳缓冲液(10′储存液),10′加样缓冲液,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。
2.操作步骤
1)用1′TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
2)在胶上选定两个加样孔,分别加入少量(10μl)和大量(50μl)DNA酶切产物,电泳。
3)电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道(一般选择位于凝胶的边缘),在紫外灯下找到目的DNA带,用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意:含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料,也不用紫外灯照射!
4)将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐,根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置,用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶(尽量不要多余的凝胶),转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。
5)按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明,纯化回收目的片段。
纯化/回收试剂盒组成:
溶液A:6MNaClO4,0.03MNaAc,pH5.2,少量酚红;
溶液B:3MNaAc;
溶液C:用时加入35ml无水乙醇;
溶液D:TE缓冲液。
胶回收步骤如下:
a.将切下的胶带放入1.5ml离心管中,按照1:3(胶带重量:溶液A的体积)的比例加入溶液A;
b.50℃水溶10min,胶带完全要求完全溶化,其间可振荡助溶2~3次,待溶化后置室温加入15μl溶液B,充分混匀;
c.将溶液置于离心柱中,静置2min,10000rpm离心20s;
d.倒掉液体,加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s,弃液体,重复该步骤一次;
e.12000rpm离心1min,甩干剩余液体以除去残余乙醇;
f.将离心柱置于新的离心管中,室温敞开离心管盖放置5~10min,使乙醇挥发殆尽;
g.加入20~30μl溶液D(使用前50℃水浴),静置2min;
h.12000rpm离心1min,管底溶液即为所需DNA,将DNA贮存于-20℃可长期保存
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