基本方案1考马斯亮蓝染色

检测范围为〇.3〜lMg每蛋白质条带。

材料（带V项目见附录1)

聚丙烯酰胺凝胶（单元12.3)

考马斯亮蓝、银染用固定液

考马斯亮蓝染液

甲醇/乙酸脱色液

7%(V/V)水乙酸

Whatman3MM滤纸（可选）

干胶仪（可选）

1.将聚丙烯酰胺凝胶放入塑料容器中，加入3〜5倍胶体积的固定液，室温下摇床上振荡2h。

2.弃去固定液，加入考马斯亮蓝染液振荡4h。

3.弃去染色液，用50ml左右固定液清洗凝胶。

4.弃去固定液，加入甲醇/乙酸脱色液振荡2h。

5.弃去脱色液，加入新鲜脱色液继续脱色，直至凝胶背景和条带清晰。可将凝胶储存于7%水乙酸中，或者储存于含水密封塑料袋中，4°C可储存一年左右。

6.若有需要，可将凝胶拍照。

7.若有需要，制成干胶可永久保存凝胶。将凝胶置于两张Whatman3MM滤纸上并用塑料纸覆盖，在80°C干胶仪中干燥1〜2h。

基本方案2银染

材料

聚丙烯酰胺凝胶（单元12.3)

考马斯亮蓝、银染用固定液

甲醇/乙酸脱色液

10%(V/V)戊二醛溶液（从50%储存液现配；Kodak)

硝酸银溶液

显色液

Kodak快速固定液A

Whatman3MM滤纸（可选）

干胶仪（可选）

注：操作时戴好手套，避免指纹留于凝胶上。

1.将凝胶放入塑料容器中并加入5倍胶体积的固定液，室温下摇床上缓慢振荡30min以上。

2.弃去固定液，加入5倍胶体积的甲醇/乙酸脱色液固定凝胶，缓慢振荡60min以上。

3.弃去脱色液，加入5倍胶体积的10%戊二醛溶液，在通风橱中缓慢振荡30min。

注意：戴手套并在通风橱中操作。

4.弃去戊二醛溶液，用水清洗凝胶4次以上，每次水洗时间30min以上，最好最后一次能清洗过夜。

5.弃去洗液，用5倍胶体积的硝酸银溶液染色（覆盖胶）15min，剧烈振荡。

注意：染色后马上弃去硝酸银溶液并用清水冲洗。

6.把凝胶放入另一塑料容器中，用去离子水清洗5遍，每次缓慢振荡lmin。

7.将25ml显色液用500ml水稀释，把凝胶放入另一容器中，加入足够量显色液剧烈振荡。显影至目的条带清晰而背景无色，若显色液变成棕色，可更换新鲜显色液。

8.将凝胶放入Kodak快速固定液A中5min，若有需要，可用浸润的棉球擦去凝胶表面残留的银。

9.弃去快速固定液，并用清水彻底清洗凝胶（4或5次）。

10.尽快将凝胶拍照。

11.制成干胶可长期保存（见基本方案1，步骤7)，或者将凝胶储存于密封的塑料袋中(可保存6〜12个月）。

基本方案3SYPROOrange或SYPRORed荧光染色

检测范围为1〜2ng每蛋白质条带。SYPROOrange染料推荐使用氩激光扫描器，而SYPRORed染料使用绿He-Ne或Nd/YAG激光扫描器。这两种染料都需要紫外或宽带照明的激发并在有适当胶情况下，用CCD照相系统显色。

材料

VSYPROOrange或SYPRORed荧光染液

7.5%(V/v)乙酸

0.1%(V/v)Tween20

1.使用SDS-PAGE电泳分离蛋白质（单元12.3)，但电泳缓冲液中SDS的浓度为0.05%，而非一般情况下的0.1%。需用新鲜配制的SDS储存液来配制电泳缓冲液。

2.将SYPROOmnge或SYPRORed荧光染液倒入一个清洗干净的小玻璃皿中。一或两块标准大小的凝胶使用50ml左右染色液，大型凝胶则需500〜750ml染色液。

对于低浓度凝胶和小分子质量蛋白质而言，将染色液的乙酸浓度从7.5%提高到10%，可以使得凝肢上蛋白质有更好的保持力而不降低灵敏度。

3.将凝胶放入染色液中，用铝箔盖住玻璃皿使凝胶避光，或者可将凝胶置于密封的塑料袋中染色，染色液的体积不变。在室温下缓慢振荡1〇〜6〇min。

4.回收染色液并可重复使用（最多4次）。用7.5%乙酸彻底冲洗凝胶（<lmin)，若有需要，也可将凝胶在染色液中避光过夜。

5.将凝胶在0.1%Tween20溶液中温育脱色过夜，或者更换数次7.5%乙酸来脱色。

6.将凝胶拍照观察。

基本方案4SYPRORuby荧光染色

SYPRORuby染料可使糖蛋白、脂蛋白、钙结合蛋白、纤维蛋白和其他难以染色的蛋白质染色，但不影响蛋白质的后续Edman测序或质谱分析，将凝胶置于塑料支持物上也不影响SYPRORuby染色。

材料

单向或双向聚丙烯酰胺、IEF凝胶（单元12.3)

双向聚丙烯酰胺凝胶SYPRORuby染色用固定液

IEF凝胶固定液：40%(VAO甲醇/10%(m/V)三氯乙酸

n/SYPRORuby蛋白质凝胶染色（分子探针）

10%(V/V)甲醇（或乙醇）/7%V/V)乙酸

2%(V/V)甘油

旋转摇床

la.单向聚丙烯酰胺凝胶：直接跳至步骤2(无需固定）。

lb.双向聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺凝胶用适量SYPRORuby染色固定液固定3〇min

乙醇和乙酸的结合会形成乙酸乙酯，这是一种毒性物质，并且会影响蛋白质的质谱分析。

lc.IEF凝胶：用40%甲醇/10%三氯乙酸溶液固定3h后，用蒸馏水冲洗三遍，每遍IOmin

2.将凝胶转移至适当大小的聚丙烯或PVC平皿中，加入未经稀释的适量SYPRORuby蛋白质凝胶染色液，连续温和振荡。如在50r/min转速的旋转摇床上，为使蛋白质呈现最大灵敏度，单向或双向凝胶需温育3h以上，而IEF凝胶则需温育过夜。

3.为了降低背景荧光和增强灵敏度，将凝胶转至干净的染色皿中并用10%甲醇（或乙醇)/7%乙酸溶液清洗30min，聚丙烯酰胺凝胶清洗一次即可，IEF凝胶则需清洗三次。

4.可选（永久保存）：将凝胶置于2%(v/V)甘油中室温下孵育30min，用干胶仪使染色好的凝胶干燥。

5.将凝胶拍照并观察结果。

备选方案1聚丙烯酰胺凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色

检测范围为1〜16ng磷蛋白每条带。对于单体磷蛋白而言，信号强度与磷酸基团的数量有关，并与超过三个数量级呈线性关系。

材料

包含目的蛋白的样品

甲醇，质谱级

三氯甲焼，质谱级

IXSDS样品缓冲液

磷蛋白标准品（PeppermintStick磷蛋白分子质量标准品，Molecularprobes;也可见表12.4.1)

磷蛋白凝胶用固定液

Pro-QDiamond麟蛋白凝胶染色液（MolecularProbes)

V磷蛋白凝胶脱色液（也可购于MolecularProbes公司）

聚苯乙烯染色皿（如称重皿）

旋转摇床
1.样品脱脂脱盐，将包含150〜300ug蛋白质的150M1样品放入1.5ml微量离心管中。加入600ul甲醇、150ul三氯甲烷和450ul蒸馏水，每加一步涡旋混匀，室温下12000r/mim离心5min，弃去上层相，保留界面处的白色离心盘，加入450ul甲醇并涡旋混匀。

2.再次离心，弃去浮在表面的物质。用Speedvac蒸汽机干燥沉淀物，用标准IX电泳样品缓冲液重悬沉淀。

3.将样品与磷蛋白标准品、磷酸化和非磷酸化对照一起电泳（单元12.3)，为了检测到少量磷蛋白，使用和典型考马斯亮蓝染色相近的蛋白质量（见基本方案1)。
小型凝肢
4a.将凝胶转移至一个用70%乙醇洗净的染色平皿中，用IOOml左右磷蛋白小型胶用固定液（含乙酸）将凝胶浸没，在室温下温和振荡至少30min。例如，在50r/min转速的旋转摇床上孵育。若有需要，重复固定，将凝胶上的SDS去除干净，或者固定过夜。

5a.将凝胶在IOOrnl左右水中温和振荡10min，重复清洗一次。

6a.将凝胶置入50mlPro-QDiamond磷蛋白凝胶染色液中避光孵育75〜120min。

7a.在室温下将凝胶置于80ml磷蛋白凝胶脱色液中避光孵育3h左右，其中更换两次脱色液（如赙育3次，每次60min)。用适当的仪器将凝胶成像并存档。