组织染色方法实验一方案4 外周神经系统银染方法：肌梭的支配实验

蚂蚁淘 /发布时间:1628530202 /浏览量:301

实验方法原理	在染色良好的情况下，还原银方法的最大优点是能够显示组织的一个区域或整个小感觉器官，如肌梭完整的神经支配。在大部分已发表的衍生法中，对分段的材料已进行了参数优化，但在某些情况下，染整块组织可能更有用，染色后取下感兴趣的结构。我们在研究哺乳动物肌梭神经支配中就采用此方法，从甲苯胺蓝和焦宁染色的1um系列树酯切片中，用更费力的重构法解决了肌梭神经支配的问题（第一章)。如在介绍中所提及的，这些不同的方法对同一问题提供了略微不同的信息。因此，用系列切片方法,可以很容易地从头到尾追踪所有三种类型的单个梭内肌纤维（称作袋状1、袋状2和链状纤维)，因此，完全有信心可以追踪到全部的有髓轴突（假如重要的切片不丢失)，但未必能追踪到最细的无髓轴突，因为它的直径小于光学显微镜的分辨度。相反地，用分离组织的银染方法，不能在整个长度上追踪到单个链状纤维，但追踪有髓和无髓轴突时没有困难，由于胶状银颗粒的光散射，可能也追踪到了一些小于光学显微镜理论分辨率直径的轴突。
实验步骤	步骤此方法源自Barker和Ip(1963)。一、固定在新配制的含水合三氯乙醛lg、95%乙醇45ml、蒸馏水50ml和浓硝酸ImI的溶液中放5d。二、冲洗在流水中放24h。三、碱化在含95%乙醇25ml、巴斯德移液管1滴氨水（比重0.88,约35%w/w)中放24h(这是原始的方法，可以根据系统需要和经验确定最佳pH)。四、银染吸去和排掉过剩液体，肌肉在37℃1.5%w/w硝酸银中孵育4d（时间对于成功与否至关重要。鉴于以前的文献作者研究大的肌肉，本研究给出的值不同于原始的文献。数年前，在遇到了染色不充分的问题后，笔者对实验方法中所有重要的步骤都进行了改良，虽然在某种程度上可以通过改变硝酸银的浓度来弥补染色不充分的问题，但到目前为止，显然最重要的是银染过程，尤其是银染的时间。银染时间太短，导致广泛着色，特别是细胞核，因此使轴突的染色不明显，同样也证实了Palmgren所观察到的结果(1960)。或许正好与直觉相反，银染时间太长，导致组织的整个区域不被着色，包括轴突，而小的区域被强染色。这些研究证明，以上描述的不同的银染是一个动态的过程，没有一个稳定的终点。因此，在处理一个新的标本时，有必要采用重^的方法，首先决定正确的时间，然后通过观察染色的质量调整时间。对于任何特定的标本，根据笔者的经验，通过系统的试验，选择最佳时间，几乎总能给出极好的或至少令人满意的结果。）五、还原（显影）在新配制的含对苯二酚2g和25%蚁酸IOOml的溶液中放2d(倘若时间足够长，确实到达了一个稳定的终点)。六、清洗 1.在蒸懐水中漂洗。 2.在分离组织前放入甘油中清洗数日和储存。七、包埋用一个树酷围成的圆形盖玻片分离放在甘油中的肌梭和肌间神经结果在一个精细染色的标本中，轴突和它的终末在灰黄色（稻草色）到淡灰色的背景下呈黑棕色或几乎呈黑色，在背景下可能很难区分出核，但常常可见肌节、髓鞘在正常情况下不着色，但由于轴突中相应部位的缩窄，雷诺氏节的位置清晰。在高分辨率的情况下，常可观察到还原的银沉积呈纤丝状或细丝状的特征。此外，并非整个轴突都会着色，特别是不能完整地观察到延伸的感觉末梢，详见Banks(1994)。

实验方法原理

在染色良好的情况下，还原银方法的最大优点是能够显示组织的一个区域或整个小感觉器官，如肌梭完整的神经支配。在大部分已发表的衍生法中，对分段的材料已进行了参数优化，但在某些情况下，染整块组织可能更有用，染色后取下感兴趣的结构。我们在研究哺乳动物肌梭神经支配中就采用此方法，从甲苯胺蓝和焦宁染色的1um系列树酯切片中，用更费力的重构法解决了肌梭神经支配的问题（第一章)。如在介绍中所提及的，这些不同的方法对同一问题提供了略微不同的信息。因此，用系列切片方法,可以很容易地从头到尾追踪所有三种类型的单个梭内肌纤维（称作袋状1、袋状2和链状纤维)，因此，完全有信心可以追踪到全部的有髓轴突（假如重要的切片不丢失)，但未必能追踪到最细的无髓轴突，因为它的直径小于光学显微镜的分辨度。相反地，用分离组织的银染方法，不能在整个长度上追踪到单个链状纤维，但追踪有髓和无髓轴突时没有困难，由于胶状银颗粒的光散射，可能也追踪到了一些小于光学显微镜理论分辨率直径的轴突。

实验步骤

步骤

此方法源自Barker和Ip(1963)。

一、固定

在新配制的含水合三氯乙醛lg、95%乙醇45ml、蒸馏水50ml和浓硝酸ImI的溶液中放5d。

二、冲洗

在流水中放24h。

三、碱化

在含95%乙醇25ml、巴斯德移液管1滴氨水（比重0.88,约35%w/w)中放24h(这是原始的方法，可以根据系统需要和经验确定最佳pH)。

四、银染

吸去和排掉过剩液体，肌肉在37℃1.5%w/w硝酸银中孵育4d（时间对于成功与否至关重要。鉴于以前的文献作者研究大的肌肉，本研究给出的值不同于原始的文献。数年前，在遇到了染色不充分的问题后，笔者对实验方法中所有重要的步骤都进行了改良，虽然在某种程度上可以通过改变硝酸银的浓度来弥补染色不充分的问题，但到目前为止，显然最重要的是银染过程，尤其是银染的时间。银染时间太短，导致广泛着色，特别是细胞核，因此使轴突的染色不明显，同样也证实了Palmgren所观察到的结果(1960)。或许正好与直觉相反，银染时间太长，导致组织的整个区域不被着色，包括轴突，而小的区域被强染色。这些研究证明，以上描述的不同的银染是一个动态的过程，没有一个稳定的终点。因此，在处理一个新的标本时，有必要采用重^的方法，首先决定正确的时间，然后通过观察染色的质量调整时间。对于任何特定的标本，根据笔者的经验，通过系统的试验，选择最佳时间，几乎总能给出极好的或至少令人满意的结果。）

五、还原（显影）

在新配制的含对苯二酚2g和25%蚁酸IOOml的溶液中放2d(倘若时间足够长，确实到达了一个稳定的终点)。

六、清洗

1.在蒸懐水中漂洗。

2.在分离组织前放入甘油中清洗数日和储存。

七、包埋

用一个树酷围成的圆形盖玻片分离放在甘油中的肌梭和肌间神经

结果

在一个精细染色的标本中，轴突和它的终末在灰黄色（稻草色）到淡灰色的背景下呈黑棕色或几乎呈黑色，在背景下可能很难区分出核，但常常可见肌节、髓鞘在正常情况下不着色，但由于轴突中相应部位的缩窄，雷诺氏节的位置清晰。在高分辨率的情况下，常可观察到还原的银沉积呈纤丝状或细丝状的特征。此外，并非整个轴突都会着色，特别是不能完整地观察到延伸的感觉末梢，详见Banks(1994)。

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