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蛋白质间相互作用研究方法：免疫共沉淀
蚂蚁淘
/发布时间:1545759827 /浏览量:204
相互作用在生理上的证实和探索 l通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1．用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min。 3．收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。 4．加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。 5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。 6．吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。 7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。 8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min。 10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。 11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
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