1.在培养皿中加入1mmol/LEDTA/1mmol/LEGTA的PBS溶液，收获细胞。此程序比通常的胰蛋白酶消化时间长。4℃1000g离心5分钟。操作始终在冰上进行。

2.用4mlPBS+0.1%叠氮化钠和1%BSA或热的灭活血清洗细胞。

3.计数细胞，每个样品的最小浓度为1X10⁶/ml。

4.将样品等分为50μl小体积的含0.1%叠氮化钠和1%热的灭活血清的PBS溶液。

5.加合适滴度的初始抗体，用系列稀释确定合适滴度范围。

6.在冰上孵育细胞30分钟。

7.每个样品中加入4mlPBS+叠氮化钠和BSA，轻轻混合。

8.1000g离心细胞5分钟。

9.用4mlPBS+叠氮化钠和BSA洗样品。

10.1000g离心细胞5分钟。

11.在适当体积的PBS+叠氮化钠中重悬细胞。

12.加合适滴度的次级抗体，用与起始滴度相近的范围确定所需量。

13.在冰上孵育细胞30分钟。

14.每个样品中加入4mlPBS+叠氮化钠和BSA，轻轻混合。

15.1000g离心细胞5分钟。

16.在相近体积的PBS+叠氮化钠和BSA中重悬细胞，终浓度为1X10⁶~5X10⁶/ml。