一、材料

1.缓冲液与溶液

乙酸铵（10mol/L）

DTT(1mol/L)

EDTA(0.5mol/L，pH8.0)

乙醇

HCl(2.5mol/L)

NaOH(3mol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V）

胰RNA酶抑制剂（20单位/μl)

SDS(10%m/V)

Tris-Cl(1mol/L，pH7.4)

2.酶和缓冲液

反转录酶

10X反转录酶缓冲液

3.核酸与寡核苷酸

含有dATP、dGTP和dTTP各20mmol/L的dNTP溶液

dCTP(125μmol/L)

长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物

模板mRNA

4.放射性化合物

[α-³²P]dCTP(10mCi/ml，比活性为>3000Ci/mmol)

5.专用设备

冰水浴

SephadexG-50离心柱，平衡于TE（pH7.6）

预热至45℃、68℃和70℃的水浴或加热板

二、方法

1.将1μgpoly(A)⁺RNA转移至消毒的微量离心管。用无RNA酶的水将溶液的体积调至4μl。盖紧微量离心管盖，于70℃加热5min，然后迅速将离心管转至冰水浴中。

2.在微量离心管的冷溶液中加入：

10mmol/LDTT                                   2.5μl

胎盘RNA酶抑制剂                             20单位

随机脱氧寡核苷酸引物                         5μl

10X反转录缓冲液                                2.5μl

20mmol/LdGTP、dATP和dTTP溶液 1μl
 
125μmol/LdCTP溶液                         1μl

10mCi/ml[α-³²P]dCTP

(比活性为>3000Ci/mmol)                 10μl

无RNA酶的水                                    加至24μl

反转录酶（200单位）                         1μl

3.加入下列试剂以终止反应：

0.5mol/LEDTA(pH8.0)               1μl

10%（m/V）SDS                         1μl

充分混合管中的试剂。

4.在反应管中加入3μl3mol/LNaOH，68℃温育混合物30min以水解RNA。

5.使反应混合物的温度冷却至室温，加入10μl1mol/LTris-Cl（pH7.4）以中和溶液，混匀，然后加入3μl2.5mol/LHCl。取极小量液体滴在pH试纸上，以检测溶液的pH。

6.用酚：氯仿抽提纯化cDNA。

7.用离心柱层析或在2.5moI/L醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的dNTP分离。

8.用三氯乙酸（TCA）沉淀法或DE-81滤膜结合法来确定放射性标记dNTP掺入的比例。