测定蛋白质与DNA结合位点的电泳迁移率变动分析法相关交流-蚂蚁淘在线

测定蛋白质与DNA结合位点的电泳迁移率变动分析法

蚂蚁淘 /发布时间:1545759819 /浏览量:83

放射性标记DNA探针的制备

l聚丙烯酰胺凝胶的制备

1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。

lDNA的标记

1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。

2．向酶切反应混合液中加入

[α－³²P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基)10μl

dCTP(2mmol/L)1μl

dGTP(2mmol/L)1μl

dTTP(2mmol/L)1μl

DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl）1μl

室温温育反应体系30分钟。

3．加入7μl10×上样缓冲液终止反应。

l标记探针的分离

1．将反应混合物上样于非变性凝胶。

2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。

3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。

4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。

5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm²）后，放入微量离心管中。

6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。

7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。

8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。

9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约10⁴cpm/μl。

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蛋白质与DNA结合反应

l聚丙烯酰胺凝胶的制备

1．按（三）中步骤灌制一块5％非变性聚丙烯酰胺凝胶，用10×TGE缓冲液配制成终浓度为1×TGE的凝胶。

l结合反应

1．按下表中试验设计加样建立结合反应。向各个反应体系中加入蛋白提取物启始反应，温和吹吸或轻叩管底混匀反应物。

管号	DNA探针（μl）	poly(dI-dC)•poly(dI-dC) （μl）	10×BB （μl）	H₂O （μl）	蛋白抽提液（μl）
1	1	2	3	24	0
2	1	2	3	23	1
3	1	2	3	21	3
4	1	2	3	19	5
5	1	2	3	14	10
6	1	0	3	22	4
7	1	0.5	3	21.5	4
8	1	1	3	21	4
9	1	3	3	19	4
10	1	3	3	17	4

2．室温温育结合反应体系30分钟。

3．向每个样品中加入3μl上样缓冲液后混匀，上样于5％非变性聚丙烯酰胺凝胶。

4．在5～10V/cm电压下，1×TGE缓冲液中电泳3～4小时。电压大小取决于使用的DNA片段的长度。通常用7V/cm。

5．从电泳装置上卸下玻璃，去掉垫片，分开玻璃板，使凝胶粘附于其中一块玻璃板上。将一张干燥的Whatman3MM滤纸覆盖在凝胶上，小心剥下滤纸以使凝胶粘附于纸上。用保鲜膜覆盖凝胶，再用凝胶干燥器80℃干燥凝胶1小时。

6．将干燥凝胶对X光片在－80℃曝光过夜。

7．分析数据。

非变性聚丙烯酰胺

1．组装凝胶灌制装置，包括两块玻璃板（19.5cm×19.5cm和19.5cm×17cm）及插于三个侧面的垫片（1.5mm厚）。

2．按下表混合下列成分配制成5％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：

丙稀酰胺（38％）/双丙稀酰胺（2％）贮液6.25ml

TGE（10×）5ml

APS（10％）500μl

用水定容至50ml，加入50μlTEMED，充分混匀，将溶液灌入凝胶灌制装置，插好梳子。

3．凝胶聚合（约30分钟）后，移去梳子和底部垫片，将玻璃板装入电泳槽，在上下贮液槽中装满1×TGE。冲净加样孔，除去可能存在于加样孔内和/或凝胶下的气泡。

4．室温下保存凝胶直至上样，应当天使用凝胶。

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