磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定

l磷酸化作用化学计量的确定

1．在冰上建立下列反应混合液：

Tris-HCl（50mmol/L；pH8.0）/MgCl₂（10mmol/L）250μl

ATP（10mmol/L）1μl

纯化的DNA结合蛋白（1mg/ml）4μl

[γ^-32P]ATP（13μCi）1.3μl

2．将反应液混合物分成125μl的两个部分，记为A部分和B部分。B部分将被用于动力学实验。

3．在6个干净管中各加入20μlA部分溶液，然后各管中依次加入0，0.5，1，2，3和4微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应30分钟。

4．将10μl每一磷酸化测试混合液点在一张2cm×2cm的Whatman3MM滤纸上，将该滤纸在10％TCA/1%焦磷酸钠溶液中洗10分钟（每张滤纸用5ml溶液）。更换溶液重复洗两次。用100％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计数来确定每个样品中磷蛋白的掺入量。

5．在每个管中加入1.1μl100％TCA以沉淀管中剩余的10μl磷酸化测试混合液。在冰上放置20分钟，室温下用微型离心机在10000r/min离心10分钟以收集蛋白质沉淀。先用90％后用100％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀5分钟。

6．将样品加到SDS－聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在160V下1×电泳缓冲液（10×贮液配制）中电泳40分钟。用Saran®膜包裹湿胶，对X光片曝光3小时左右。

7．以放射自显影胶片为模板，切下与DNA结合蛋白相对应的被标记的条带。用5倍体积30％过氧化氢在37℃处理凝胶条带6～12小时以溶解DNA结合蛋白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺入量。

8．用以下两种方法测定待测液中的总掺入量：

a．将9μl分析缓冲液（50mmol/LTris-HClpH8.0/10mmol/LMgCl₂）加到1μlA部分溶液中，将混合液点在一张2cm×2cm的Whatman3MM滤纸上。不要用TCA处理滤纸。对滤纸所发出的放射性进行计数。

b．将1μlA部分溶液加到适当体积的30％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射性进行计数。

9．计算掺入到蛋白质中的磷酸的莫尔数。在本实验中，每个分析包含800pmolATP和8pmol（0.3μg）蛋白（如果待测DNA结合蛋白是GBF1的话，其分子量为37000）。1％掺入蛋白中的放射性相当于每莫尔蛋白含有1摩尔磷酸。

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l磷蛋白形成动力学的测定

1．向B部分中加入18微单位蛋白激酶并在室温下放置。在第0，5，10，20，25和30分钟时各取20μl试样。取出后立即终止磷酸化反应，取其中10μl点在一张2cm×2cm的Whatman3MM滤纸上，并用TCA处理，剩余10μl用1.1μl100％TCA沉淀。

2．来自B部分样品的处理方法与A部分相同。

3．确定磷蛋白形成的速率。

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l变性SDS－聚丙烯酰胺凝胶的制备

磷酸化反应洗滤纸时是制胶的良机。

1．依次混合下列组分以配制10％丙稀酰胺分离胶溶液：

丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％）3.38ml

Tris-HCl（1mol/L;pH8.8）3.80ml

SDS（10％）0.10ml

加水至10ml。加入50％APS12μl和TEMED10μl，重复混匀（这些足以灌制两块8.3cm×7.4cm×0.075cm的微型凝胶）。将溶液注入灌胶的平板夹层中使其充满两块平板间空隙的80％，用水覆盖凝胶，静置10分钟使凝胶聚合。吸去水层。

2．依次混合下列组分以配制4％丙稀酰胺浓缩胶溶液：

丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％）0.27ml

Tris-HCl(1mol/L;pH6.8)0.25ml

甘油0.20ml

SDS（10％）20μl

加水至2ml，再加入50％APS2.4μl和TEMED2μl，并将溶液加到分离胶上至低于矮平板上沿5mm处，插上梳子。该胶可在室温下存放数小时或装在密封的塑料袋中于4℃放置数天备用。

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用放射性标记的磷蛋白和非标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化蛋白与DNA的结合

l迁移率变动测定

1．将2μl近似饱和磷酸化的DNA结合蛋白加入到110μl未用poly(dI-dC)配制的迁移率变动缓冲液中。

2．取20μl到一个干净管中作为对照（样品1），在剩余92μl中加入poly(dI-dC)至终浓度为0.07μg/μl，并取出4份各20μl的等分试样（样品2～5）。

3．分别在样品2，3和4中加入0，2和10ng非标记的DNA探针，在样品5中加入0.1μg超声处理的鲑精DNA，并将样品1～5于室温放置30分钟。

4．在每个样品中加入5μl非变性上样缓冲液，并将样品加到非变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，以低于100V的电压在1×电泳缓冲液中电泳3小时。用Saran®膜包裹湿胶，对X光片过夜曝光。更好的方法是在Whatman3MM滤纸上干燥凝胶，加Kodak增感屏对X光片曝光。

l非变性聚丙烯凝胶的制备

在结合分析反应时倒胶比较合适。

1．依次混合下列组分以配制4％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：

丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％）6.6ml

电泳缓冲液（10×）5ml

加水至50ml，并加入50％APS60μl和TEMED50μl。

2．充分混匀，将溶液倒入垂直凝胶电泳装置的平板夹层中（14.5cm×17cm×0.2cm）。本方法不需浓缩胶，因为分离胶具有自浓缩作用。聚合约需10分钟。该胶可浸泡在1×电泳缓冲液中于4℃保存数周备用。