上样缓冲液

2010-03-27【求助】加入上样缓冲液,样品立即出现沉淀,为何?

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找公司合成了一个30AA的阳离子多肽(纯度90%),加水溶解至6ng/μl,加入2x上样缓冲液后,立即出现沉淀,加热至99度10分钟仍不溶解,离心取上清电泳,蛋白Marker条带清晰,样品无条带形成,在预期位置的上方10~15kd处出现弥散状着色区,请问:
1)为何出现沉淀,怎样才能避免沉淀的出现?
2)为何没有预期大小的3.5kd条带出现?10~15kd处可能是什么?是不是分子聚合?若是分子聚合,怎样解聚?
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回复:时间:2010-04-05

6ng/μl=6μg/ml,这个浓度太低了吧,电泳如何看得到?

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回复:时间:2010-04-07

有6ng/μl与30ng/μl,上样30ng/孔与150ng/孔足够了,均无条带形成!

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回复:时间:2010-04-07

txstbbm有6ng/μl与30ng/μl,上样30ng/孔与150ng/孔足够了,均无条带形成!30ng/孔与150ng/孔对SDS-PAGE来说是不够的。考染正常条带要求上样量为10μg,也就是1mg/ml的样品上样量为10ul。要能看到明显的条带,我的经验是不能少于1μg=1000ng。对重组药品的QC检测,中检所考染要求上样量大于15μg。

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回复:时间:2010-04-03

找公司合成了一个30AA的阳离子多肽(纯度90%),加水溶解至6ng/μl,加入2x上样缓冲液后,立即出现沉淀,加热至99度10分钟仍不溶解,离心取上清电泳,蛋白Marker条带清晰,样品无条带形成,在预期位置的上方10~15kd处出现弥散状着色区,请问:1)为何出现沉淀,怎样才能避免沉淀的出现?2)为何没有预期大小的3.5kd条带出现?10~15kd处可能是什么?是不是分子聚合?若是分子聚合,怎样解聚?

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回复:时间:2010-03-31

有沉淀出现,可能是样品中含有钾离子,钾离子与SDS会形成不溶性的沉淀。解决办法:透析除盐再浓缩。

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回复:时间:2010-04-02

如果因钾离子形成沉淀,应该不会影响多肽电泳结果才对,有谁跑过碱性多肽(pi=11)的电泳?碱性多肽电泳与其他电泳很不一样?应该注意什么问题?

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回复:时间:2010-04-06

SDS-PAGE多肽的酸碱性关系不大的,个人感觉主要还是沉淀的问题,加上loADIngbuffer后,添加一定的Sarkosyl,混匀至其澄清为止,然后再上样试试。另外,由于分子量小,建议使用Tricine胶,问题应该可以解决。

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回复:时间:2010-04-01

先谢谢上面的各位兄弟,还有哪位高人过来帮忙解答一下?