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Cell Disruption and Subcellular Fractionation

蚂蚁淘  /发布时间:1631122203 /浏览量:293   

CellDisruptionandSubcellularFractionationContributor:SupryaJayadevDate:July31,1991NitrogenBomb1)Harvestcellsandwash2timeswithPBS.2)ResUSPendfinalpelletinrelaxationbuffer.(20ml/1X109cells)3)PressurizewithN2for20minutesat350psi,40Cwithconstantstirringinanitrogenbomb.4)CollectcavitatedropwiseintoEGTA,pH7.4.-->ThefinalEGTAconcentrationshouldbe1.25mM.Fractionation5)Pelletthenucleiandunbrokencellsbycentrifugingthecavitateat500g,40Cfor10min.-->ThispelletisknownastheP1fraction.6)Thesupernatantshouldbedecantedandlayeredontoaprecooled(to40C)PercollgrADIent.

ReagentsRelaxationbuffer(withoutEGTA):100mMKCl3mMNaCl1mMATP(Na)23.5mMMgCl210mMPIPESpH7.3

NOTERelaxationbuffer,ahigh-potassium,low-sodium,calcium-freebuffercontainingMgATP,wasdesignedtomimiccytoplasmicconditionsintheneutrophil,basedinpartuponconditionsshowntopromotecytoplasmiocrelaxationinnonmusclecontractilesystems.

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