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DNA的Tm值测定实验一紫外分光光度法
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| 实验方法原理 | 当DNA的稀盐溶液加热到80～100℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链分开,形成无规线团。一系列物化性质也发生改变:260nm区紫外吸收值增高(增色效应),粘度降低,浮力密度降低等。DNA的变性的特点是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的范围。通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度(meltingtemperature),用Tm表示。DNA的Tm值一般在70～85℃之间。 DNA的Tm值大小与下列因素有关: 1. DNA的均一性。均一性越高的样品,熔解过程越是发生在一个很小的温度范围。 2. G-C的含量。含量越高,Tm越高,由Tm值可推算出GC含量。其经验公式为:(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44。 3. 介质中的离子强度。一般离子强度较低的介质中DNA的熔解度较低,熔解度的范围也较宽。 Tm值的测定与变性条件的研究可为我们提供有关DNA核苷酸组成的信息,同时也有助于判断DNA的纯度与数量。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA |
| 试剂、试剂盒 | 氯化钠柠檬酸乙二醇 |
| 仪器、耗材 | 紫外分光光度计石英杯 |
| 实验步骤 | 1.用循环恒温装置测Tm 按操作规程打开紫外分光光度计预热20min。设定循环恒温装置于25℃,进行光吸收的初步测定。若是自制DNA,先于25℃测其A260,用标准氯化钠-柠檬酸溶液稀释至A260=0.4。并注意使其终体积适合于比色杯(1ml或3ml)。 以标准氯化钠-柠檬酸溶液调整260nm下光吸收零点。然后将装有待测的稀释DNA溶液的比色杯置于分光光度计 的样品室中,平衡3min后测A260。再将温度升高到50℃,取出比色杯将其内壁的气泡赶出,测A260。继续升温到80℃,平衡5min后测A260。 按每次升高2℃的方式升温,然后平衡温度(5min),记录A260。按此方式一直进行到A260不再升高为止。 2.用恒温水浴装置测Tm 最少设定6个恒温水浴装置(50℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃)。按操作规定预热紫外分光光度计20min。 DNA溶液的浓度控制在A260=0.4。取试管(最少8支),向其中各加入3mlDNA溶液,盖上帽子,温育15min。其中一支试管放室温,两支试管放100℃,其余温度水浴各一支,温育完后迅速冷却试管,室温和100℃一支置于冰浴10min,而另一支100℃则缓慢冷却到室温。 测定各管DNA溶液的A260,而缓慢冷却的那支试管在室温下至少放置1h再测。 3.结果处理 计算各温度下的A260(t)/A260(25℃),并以此比值对温度作图,连接各点成平滑曲线,估计出光吸收增加的中点,此即Tm。计算G-C%含量。 |