核体系酵母双杂交文库特点

酵母双杂交（Yeasttwohybrid）技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的是还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。欧易生物结合多年的文库构建经验，推出两套酵母双杂交文库构建体系：一是Clontech体系，在现有酵母双杂交文库构建流程（Clontech专利的BDMatchmakerTMlibrary）基础之上加入独特步骤，使文库中高丰度表达基因明显降低，从而使文库丰度均一提高筛选阳性率；二是Invitrogen体系，采用Gateway位点特异性重组技术（Invitrogen专利的CloneminercDNAlibraryconstructionkit）构建文库。 

核体系酵母双杂交文库应用

AClontech酵母双杂交体系

Clontech核体系酵母双杂交文库体系

欧易特色

■ 改进的分级分离方法，文库平均片段长度更长；
■ 均一化可有效降低高丰度基因的含量，使筛选时假阳性率明显降低；
■ 同源重组一步完成；
■ 文库可用于双杂、单杂、三杂；
■ 客户转化酵母，我们可提供100管酵母甘油菌工作液及3-5管母液。

Clontech核体系酵母双杂交文库项目流程

技术参数

BInvitrogen酵母双杂交体系

Invitrogen核体系酵母双杂交文库体系

欧易特色

■ 由mRNA反转录成cDNA构建文库，不经过PCR过程避免冗余现象，保证文库质量；
■ 根据Gateway的技术路线建库，提供的初级文库可以当做普通cDNA文库使用；
■ 次级文库质粒既可用共转又可用mating的手段筛库；
■ 如果次级文库用完可以用初级文库再次与AD载体重组获得次级文库；
■ 文库可用于双杂、单杂、三杂；
■ 如果客户需要转化酵母，我们可提供100管酵母甘油菌工作液及3-5管母液。

Invitrogen核体系酵母双杂交文库项目流程

技术参数

提供内容

●实验报告：详细实验流程、各阶段电泳图、工作液细胞密度、文库库容量、插入片段长度鉴定图等

●初级文库质粒及菌液

●次级文库质粒及菌液

体系对比

常见问题

Clontech和Invitrogen体系我们都有丰富的操作经验，老师可以任意选择，对于GC含量较高及二级结构复杂的物种我们建议选择Invitrogen体系建库，对于样本量较少的客户我们推荐用Clontech体系建库，如果某些物种有高丰度基因建议采取均一化过程。

Clontech文库所需RNA总量低，可以进行均一化处理以降低基因的冗余。既可以提供文库质粒也可以提供酵母工作液和母液。文库可以用于单杂也可用于双杂，用于双杂既可以用共转也可以用mating的方法筛库。Invitrogen酵母文库需要总RNA量较高，但是采取分离mRNA的方法，不经过PCR过程所以不会导致基因过度冗余。除了初级文库、次级文库质粒和菌液以外我们同样可以提供酵母工作液和母液。文库可以用于单杂也可用于双杂，用于双杂既可以用共转也可以用mating的方法筛库。

库容（每毫升文库菌液库容量）的计算公式：CFU/ml=平板上的克隆数/平板上涂布菌液的体积μl×n×1000μl。所代表意义：（1）n是原始菌液的稀释倍数；（2）克隆数除以涂布的体积所得数据是每微升稀释菌液所含阳性克隆数；（3）每微升稀释菌液所含阳性克隆数乘以稀释倍数所得数据是每微升原始菌液所含的阳性克隆数；（4）最后乘以1000μl，就是1ml原始菌液所含的阳性克隆总数，即每毫升文库菌液的库容量（CFU/ml）。那么总的文库库容（CFU）=CFU/ml×文库菌液的总体积（ml）。

老师拿到文库后可对文库进行质检以判断文库质量，欧易会提供一个质检流程，老师只要按照流程操作即可。文库质量的关键指标是库容、重组率及插入片段平均长度。库容并不是越高越好，欧易承诺的库容一般>106，一般物种的转录组为104，因此文库覆盖转录组100倍以上对于筛库已足够；此外，库容过高只会增加文库的冗余率。酵母双杂文库的插入片段平均长度也不是越长越好，该实验的最终目的是筛到互作蛋白，只要基因的结合区域存在就可能被筛到，并不需要全长基因。如果只追求片段长度可能会损失掉很多较短的相互作用蛋白。

案例展示

案例一：Clontech体系——DCA1作为DST转录辅激活子参与水稻的耐旱耐盐机制的调控

研究背景：

水稻是重要的粮食作物，干旱与盐害严重影响水稻的生长发育，造成作物的生长缓慢甚至死亡。研究水稻的耐旱耐盐机制以提高其产量具有深远的意义。
 

研究内容：

本研究采用酵母双杂交筛选与水稻抗逆相关基因DST的互作蛋白，并采用生理生化及分子生物学技术分析DST在水稻耐旱耐盐中的作用。研究表明：DST与DCA1相互作用；DCA1作为一个转录辅激活子在DST介导的转录调控作用中发挥作用；DCA1通过调节保卫细胞的H2O2体内平衡来控制气孔的开闭；DCA1-DST-Prx24pathway通过调控气孔运动，从而参与水稻的抗逆作用机制。（酵母双杂交实验由欧易提供技术服务）

DCA1与DST互作	DCA1与DST转录调节模式

●1.收集ZH11(OryzasativaL.japonica.cv.ZhongHua11)叶片，按照以下操作流程:（1）提取totalRNA，将cDNA克隆至pGADT7ADvector上以获得文库质粒；将DST片段克隆至pGBKT7BDvector上以获得重组载体pGBKT7/Δ72；共转筛选；（2）靶标基因全长ORF克隆至pGADT7ADvector上，与pGBKT7/Δ72共转Y2Hgold；（3）DSTORF克隆pGADT7ADvector上，靶标基因克隆至pGBKT7BDvector上，共转Y2Hgold。结果表明DCA1可与DST互作来参与水稻耐旱耐盐的调控。同时采用BiFC和pull-down进一步验证酵母双杂交实验的结果。

●2.采用亚细胞定位、双荧光素酶、qRT-PCR、EMSA等方法分析其作用机制。结果表明：DCA1过表达转基因植株对干旱和盐害表现出较高的敏感性，而DCA1突变株可通过增加气孔关闭来提高植株的耐旱耐盐性。DCA1与DST作为一个复合体通过调节保卫细胞中H2O2平衡来控制气孔的开闭，从而参与水稻耐旱耐盐作用机制的调控。

案例二：Invitrogen体系+matting——VP37与LvPT互作参与WSSV的宿主感染

研究背景：

对虾白斑综合症病毒（whitespotsyndromevirus，WSSV）能感染对虾、螯虾等各种虾类，且该病毒宿主范围广、传染力强、致死率高，是对虾养殖业最主要的病原体之一。

研究内容：

VP37在WSSV感染过程中发挥着重要的作用。采用酵母双杂交筛选与VP37互作的蛋白，随后通过Co-immunoprecipitation、Chitinbindingassay、半定量等进一步分析。结果表明：VP37通过与LvPT互作来参与WSSV宿主感染。此外，LvPT还与VP32、VP38A、VP39B、VP41A相互作用来参与WSSV感染。（酵母双杂交实验由欧易提供技术服务）

酵母文库插入片段	LvPT和VP37互作

●1.收集成虾的腿，提取DNA用于VP28PCR鉴定以分析对虾的WSSV感染情况；未感染的对虾用于后续文库构建

●2.从成虾的肠和胃中提取totalRNA，分离出mRNA并反转录合成cDNA。cDNA重组至pDONR™222vector上，转染E.coli(DH10B)以获得初级文库。初级文库质粒与modifiedpGADT7-Rec(orpGADT7-DEST)进行LR重组，并转染E.coli(DH10B)以获得次级文库Y2Hlibrary；转化Y187酵母。结果表明：文库库容为1.7×107，插入片段平均长度为1.2kb

●3.构建VP37诱饵载体（pGBKT7-37），转染Y2Hgold酵母，进行诱饵蛋白的毒性及自激活活性分析。随后进行文库筛选（mating）及序列分析。结果表明：LvPT1、LvPT2与VP37相互作用

●4.此外，采用酵母双杂交还分析了LvPT与其他膜蛋白（VP19、VP24、VP28、VP32、VP38A、VP39B、VP41A、VP41B、VP51B、VP60A，VP73）的相互作用。结果表明：LvPT1还可与VP32、VP38A、VP39B，VP41A相互作用。

案例三：拟南芥CDKG1通过调节CalS5pre-mRNA的剪接来调控花粉壁的形成

研究背景：

研究内容：

本文以拟南芥为研究对象，通过一系列的功能学实验研究表明：CDKG1通过调节CalS5pre-mRNA的剪接来调控花粉壁的形成。（酵母双杂交实验由欧易提供技术服务）

酵母双杂交验证CDKG1与RSZ33之间的互作	CDKG1通过调节CalS5pre-mRNA的剪接进而调控花粉壁的发生发展

●2.由于CDKG1蛋白中不包括RNA识别基序（RRM），且CDKG1与具有1-2个RRMs的SR蛋白相互作用，推测CDKG1可能与SR蛋白互作来结合CalS5pre-mRNA。因此采用酵母双杂交技术筛选与CDKG1互作的SR蛋白。拟南芥中有19个SR基因，将SRCDS区克隆至pGBKT7载体上；将CDKG1CDS区克隆至pGADT7载体上；随后筛选互作蛋白。采用BiFC验证酵母双杂交结果。结果表明：CDKG1与RSZ33之间存在相互作用。

●3.免疫荧光定位和免疫共沉淀分析表明：CDKG1与RSZ33互作来调节CalS5pre-mRNA的剪接，进而调控拟南芥花粉壁的
形成。

参考文献

[1]CuiLG,ShanJX,ShiM,etal.DCA1ActsasaTranscriptionalCo-activatorofDSTandContributestoDroughtand SaltToleranceinRice.PLoSGenet.11,e1005617(2015).(IF:6.661)
[2]XieS,ZhangX,ZhangJ,etal.EnvelopeProteinsofWhiteSpotSyndromeVirus(WSSV)InteractwithLitopenaeus vannameiPeritrophin-LikeProtein(LvPT).PLoSOne.10,e0144922(2015).(IF:3.057)

[3] HuangXY,NiuJ,SunMX,etal.CYCLIN-DEPENDENTKINASEG1isassociatedwiththespliceosometoregulate CALLOSESYNTHASE5splicingandpollenwallformationinArabidopsis.PlantCell.25,637-648(2013).(IF:8.538)

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