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想做EV71的CDNA感染性克隆，在引物的5‘端引入启动子序列，然后利用用T7启动子进行体外转录，转染细胞，拯救活病毒，现在有几个问题不太明白，想请教一下各位：
1.如果在引物的5’引物引入了T7启动子，3‘引物也引入了polyT,PCR扩增出全长片段，回收纯化之后可以用来直接做体外转录么？为什么看到文献里都是先把这个PCR片段连接到载体里面，扩增之后提取出来线性化之后，再进行体外转录。是不是转录对模板的量有要求？
2.如果使用一些带有T7启动子序列的载体比如pBluescriptSK，在启动子序列和酶切位点之间还有多余的一段序列，这段序列也会被启动子转录，这一小段多余的序列是否会对接下来的转染以及病毒拯救带来影响？
3.有人在做反向遗传么，哪些载体可以用来进行体外转录？插入片段为7.5K。
1.如果在引物的5’引物引入了T7启动子，3‘引物也引入了polyT,PCR扩增出全长片段，回收纯化之后可以用来直接做体外转录么？为什么看到文献里都是先把这个PCR片段连接到载体里面，扩增之后提取出来线性化之后，再进行体外转录。是不是转录对模板的量有要求？
2.如果使用一些带有T7启动子序列的载体比如pBluescriptSK，在启动子序列和酶切位点之间还有多余的一段序列，这段序列也会被启动子转录，这一小段多余的序列是否会对接下来的转染以及病毒拯救带来影响？
3.有人在做反向遗传么，哪些载体可以用来进行体外转录？插入片段为7.5K。
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回复：时间：2012-10-30
1、PCR扩增带有T7启动子序列的全长片段也是可以用来做体外转录的，但是如果把这个片段构建到载体上得到质粒以后有利于对病毒基因进行改造。体外转录对模板的量的有一定的要求，但我觉得对其质量的要求更为重要。而且是做感染性克隆的话那就要连到载体上最后成功包装出病毒来了才叫感染性克隆吧。2、5’端和3’端冗余序列的存在我觉得是会有一定影响的。不知道楼主这个感染性克隆目前进展如何，我们可以交流交流。
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