2021-08-24【求助】最近用stratagene点突变试剂盒作定点突变，老是长不出克隆，求教

发现大家都在使用KIT做突变，其实我曾经也是如此。不过就如我所言，运用KIT你就得遵循该KIT的说明，但有时候即使一个新的KIT到手却没突变出任何东西，假如再弄个阳性对照再加摸几个退火条件一个小剂量的KIT也就消耗光了，所以觉得大家能否多动脑筋想想，除了这个商业上使用的KIT以外能否有其他方法可用，自然肯定是有的。KIT最大的好处是SIMPLE，但最大的弊端也是SIMPLE。不过很开心，目前我们已经抛弃了所有的KIT照样能做出任何的突变，不需要价格离谱的酶，普通的pfu就可以。所以感觉实验是用脑袋做的，不是用手做。

请wearegod继续往下说啊。

还需要wearegod战友继续讲吗?自己带着问题去主动学习吧.最笨的办法就是先把十几年来的定点突变的技术方法都研究透,自己以后也能得心应手地设计最适合特定实验的方法.我就是这样做的,做了几十个定点突变,根据已有的条件制定最快最经济的方案,但从来没有用过试剂盒甚至根本没有想到去购买.

我当时也是用的他家的KIT，但是8Kb以下的那个定点突变还比较顺，用8KB以上的那个XL的KIT没有长出克隆，主要是PCR和转化两步最容易出问题当时有战友建议如下：先测测感受态细胞转化效率具体有多大，这类试剂盒因为转化的质粒带2个缺口，对感受态效率要求比较高。再做一个30个左右循环的扩增，琼脂糖电泳看看能不能扩增出东西，判断一下你的引物设计和PCR体系有没有问题。我因为当时用的热转，当天就把DPI消化的产物用电转的感受肽转了一下，结果长出很多克隆，可能和我们实验室的水浴箱温度不准有关系。

感谢wearegod、Pathway、Pathway的建议，我的质粒是6KD不到的，最近做了几次，最后都没长出克隆。试剂都用得差不多了，时间也耗得差不多了，最难受的是精力与激情也快磨光了。以前实验总会有些受阻，但这次确实堵得太厉害。wearegod说的，现在我也想过，只是还没有行动，有些地方也没清楚wearegod能不能具体介绍下经验，听说最后突变后连接到空质粒时比较麻烦，也听说有些同学就因为这堵住了。coffee1170330，电转可以改进转染？我做的都是用热转，当时也考虑到水浴箱的温度问题，故特意用温度计量的。还有试剂盒说热转要用Biosciece的14ml圆底试管，而我没有买到这个，用的是进口1.5ml的EP管。

我马上也要用这个kit了，现在可能没什么太大发言权楼上的说的那个问题（Biosciece的14ml圆底试管和1.5mlEP管）我也考虑过，因为加入溶液的体积总共才500ul，用1个14ml的管子似乎太浪费了，但是可能因为在大的管子了，细胞会铺的比较开，受热均匀，可以提高效率。我手头上也没有Biosciece的14ml圆底试管，打算用普通15ml离心管代替，不知道有没有过来人给点建议，是否可行？

请问您现在做出来了吗。我最近年也碰到这样的问题。pcr肯定p出来了，就是不长克隆！大家还有什么高见，帮帮我！谢谢！

请问您现在做出来了吗。我最近年也碰到这样的问题。pcr肯定p出来了，就是不长克隆！大家还有什么高见，帮帮我！谢谢！

同志们，发扬同源重组啊，什么类型的突变都可以解决啊，有钱有时也不是万能的。

现在已经做出来了。在此感谢提供帮助的所有人。关于用stratagenequickchangesitedirectedmutagenesisKit做点突变，经过自己的摸索，以及一些同仁的帮助，现在关于这个方法，自己也有一些体会。这个方法在点突变实验上在国内外还是较为流行的，查一下文献就知道，原因主要在于它相对简单和高效，直接用目的质粒作模板，一对完全互补突变引物，一步低循环PCR，扩增出引入突变的缺陷质粒（有两个开口），用Dpn1酶切消化模板质粒，消化后产物直接用于转染，整个过程两天内可完成。

关于这个方法，我的体会是，拿到试剂盒后，最好用试剂盒本身提供的对照模板质粒和引物先做一次对照实验，以确定试剂盒本身的质量和自己实验操作没问题。由于该系统的突变引物完全互补，且采用的是低循环次数，这可能会导致PCR反应产物产量较低，甚至完全没有产物，这将导致后面的转化实验细菌长不出克隆。这个问题许多实验者都会遇到，其中有实验者在其发表在核酸研究的论文中写道：WeencountereddifficultieswiththeQuick-ChangeTMprotocolinthecoursemutationalstudieswithcatalyticantibodies,wherewewerecompletelyunabletointroduceanymutationfollowingtherecommendedprotocol.这导致许多改良与改进该方法的尝试，其中主要有，1、增加PCR反应体系中成分的量如模板质粒量，Pfu酶等，2、延长延伸时间；3、改良突变引物；4、改良PCR反应步骤，两步法；5、纯化浓缩Dpn1酶切消化后产物用于转化。

其实大家做实验难免会遇到这样那样的问题，只要经历过，就知个中味，所以要互相帮助，而不是冷观和嘲笑。

楼主你好！恭喜你实验取得满意进展！我也是在用这个盒子作点突变，确定扩出产物来了，但转化后就是不见菌落。我的心情你一定特别能理解。恳请你的帮助啊！！！转化出问题？我也用过试剂盒里的XL1，用的是加氨苄（80ug/100ml）的LB平板，37度24小时都不见菌落！期待你的回复！！！

希望能得到你们的真传