SeamlessAssembly是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点，反应时间+转化时间短至20min，阳性率达95%以上。

反应原理



实验步骤

1、线性化载体的制备
可通过单酶切、双酶切或 PCR扩增制备，如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。



2、DNA片段的制备
  1. DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
   
  2. PCR扩增法引物设计原则：

• 引物的3’端必须包含18-50个能与模板DNA结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段；
• 引物的5’端必须包含15-80个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR扩增片段能与线性化载体进行重组反应。 

​3、重组反应
 1.按照如下体系操作：
  DNA 片段和线性化载体        0.5-5uL
  2*SeamlessMasterMix        5uL
  ddH₂O                      xuL  
                                       

  总反应体积                   10uL

 2.50℃反应15min，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，请将链接产物放-20℃保存。

4、转化

1. 取5uL连接液至50uL刚刚融化的DH10B感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30min。
2. 42℃水浴中热激30s。
3. 立即放置于冰上静置2min。
4. 加入300-500uL无菌培养基（不含抗生素），37℃，200-250rpm振荡培养60min。
5. 吸取200uL菌液铺板。

５．鉴定阳性重组子
 1.菌落PCR法
挑取大小适中的克隆菌至10ul无菌水中，充分混合，取2ul混合液作为PCR反应的模板，使用载体克隆位点两端的引物作为鉴定重组子的扩增引物进行PCR扩增，反应完全后取10ulPCR产物电泳鉴定.确认重组子后,将剩下的8ul混合液转接到培养基中(含抗生素)，过夜摇菌，然后抽提质粒。
 2.限制性酶切法
挑取大小中等的克隆菌至培养基中(含抗生素)，过夜摇菌培养，然后抽提质粒。用载体上的限制性内切酶进行酶切鉴定。