重组展示病毒的免疫电镜分析

材料

试剂

抗体

针对目的蛋白质或多肽的一抗

二抗（可选）

杆状病毒（蔵糖梯度纯化；SummersandSmithI9S7;KingandPosseeI”2;O^eillyetaL1994)

去离子蒸馏

使用前〇•22um滤器过滤除菌。

10%胎牛血清（FBS)稀释于PBS溶液

使用前0•22um滤器过滤除菌。

固定剂（可选)：1%戊二醛多聚甲醛的PBS溶液或2.5%戊二酸的PBS溶液

使用前用〇.22um滤器除菌。

0.15%甘氨酸的PBS溶液

使用前用〇•22um滤器除菌。

甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液

在20ml沸腾的双蒸水中加人0.3g的甲基纤维素，冰浴搅拌4——8h,然后加入80mg乙酸双氧铀，4°C放置至少Mh,4°C保存备用。

磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4〜7.5)

使用前用〇.22fxm滤器除菌，4°C保存。

蛋白-A-结合的纳米金颗粒（直径5〜IOnm)。

仪器

包被了碳和Formvar树脂的金属格栅’

滤纸

滤器（0.22um)

封口膜（Parafilm)

注射器

i.用PBS将病毒稀释到合适的浓度。

a.确定格栅上病毒的最适密度，用PBS5倍或10倍梯度（如未稀释、10^-1、1〇^-2、10^-3)稀释病毒。

可选步骤，用0.22um滤器过滤稀释的样品，让聚集病毒颗粒充分散开。

b•等分稀释好的样品，各10pJ加到每个格栅上，使病毒颗粒与之接触。

c.用步骤10的方法进行对比和包埋。可以风干。

d.电子显微镜观察格栅。

2•取100最适稀释倍数的病毒（由步骤工确定的）到格栅上，室温放置1〇〜60min。最后格栅上病毒的密度取决于孵育的时间。
作为可供选择的步骤，样品可以和固定剂混合，或者是在步骤8以后固定。

3.室温下，IOmin内用〇•15%甘氨酸洗涤格栅4次。

4.用10%FBS封闭非特异性结合位点，室温，lOmin。用滤纸吸走多余液体。

5•加入10%FBS稀释的一抗，室温孵育15〜60min。每块格栅需要5〜l〇ul。

6.室温下，15min内用10%FBS或0•15%甘氨酸洗涤5次。用滤纸吸走残余液体。作为可供选择的步骤，室温下用稀释于10%胎牛血清的桥接抗体孵育15〜60min。按步骤7的描述洗涤。这种方法只有当一抗和蛋白A的结合能力很弱（如绵羊和山羊IgG和一些单克隆抗体）或为增强所需的金的信号时才使用。

7.加人10%FBS稀释的蛋白-A-结合纳米金颗粒，室温孵育30〜60min。每块格栅需要5〜10ul。

8.室温下，20rain内用10%FBS或0•15%甘氨酸洗涤8次。

9•室温下，8min内用双蒸水洗淥4次。

作为可供选择的步骤，室温下用甲基纤维素/乙酸双氧铀负染色格栅30s,并使之风干。

10.冰上用预冷的甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液孵育样品，每IOs换一次液，换2次液。

11.将格栅转移到甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液的第三个液滴上，冰上孵育lOmin。

12.从液滴上将格栅取出，用滤纸吸去甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液使之变薄成膜，风干IOmin以上。

13.用透射式电子显微镜观察纳米金颗粒的分布情况，从而获得病毒颗粒的数据。