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杆状病毒储液制备实验一基本方案 从悬浮培养中制备
蚂蚁淘
/发布时间:1533685069 /浏览量:89
| 实验方法原理 | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 悬浮培养的Sf9细胞待接种的杆状病毒（野生型的或重组） 试剂、试剂盒 | 含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液TNM-FH 仪器、耗材 | 150mm培养瓶27℃培养箱倒置显微镜带有GH-3.7水平转子的4℃GPR离心机带螺口盖的冻存管液氮罐500ml旋转细胞培养瓶多转瓶的揽拌台
实验步骤 | 1.用50mlTNM-FH/10％FBS培养液在500ml旋转培养瓶中培养Sf9细胞，直到细胞密度达到约1×105细胞/ml（见昆虫细胞保存培养实验）。 2.室温下以1000g离心10min回收细胞，弃去上清。加入10～20ml新鲜的TNM-FH/10％FBS培养液重悬细胞团块。加入感染复数（MOI）为0.1～0.5的病毒接种（见步骤1.2）。 MOI以pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI（pfu/细胞）×[细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）] 3.将细胞重新放入旋转培养瓶中，用TNM-FH/10％FBS培养液将体积加至100ml。27℃置搅拌台上以60～80r/min恒速搅动，培养3～4天。周期性地取少量悬浮培养细胞在显微镜下观察细胞病变效应及包含体。 4.当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常是感染4～5天后），将细胞培养液移入灭菌试管中，4℃以1000g离心10min，将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取1ml上清移至几个螺口冻存管中，置液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处4℃短期保存。 注意事项 | 病毒储液也可以由悬浮生长的昆虫细胞（Sf9、Sf21和HighFive）制备：用无血清或无蛋白质的昆虫培养基来培养昆虫细胞，在100ml或500ml(只加至250ml）的旋转培养瓶中，直到细胞密度达到（1～2）×106细胞/ml。病毒应以0.1～0.5的感染复数直接加到悬浮培养液中，培养细胞4～5天，按步骤2.4收获病毒。 其他 | 展开
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