用荧光激活的细胞分类仪检测调亡细胞

1）原位缺口翻译检测裂解的DNA片段

1．取10⁶经促调亡物质处理的细胞，用1％BSA-PBS洗涤细胞后加入0.1mlFITC标记的抗CD4或抗CD8单克隆抗体，4℃20分钟。用1％BSA-PBS洗涤细胞。置冰上。

2．加入0.1ml1％多聚甲醛，置冰上5分钟，加入60％（v/v）甲醇溶液，轻轻悬浮细胞，4℃固定细胞15分钟。4℃离心500×g10分钟，去上清液。

3．加入0.1ml0.1％TritonX-100，4℃15分钟。用1％BSA-PBS洗涤细胞2次。加入50μl缺口翻译缓冲液（50mmol/LTris-HClpH7.4，5mmol/LMgCl₂,1.5U大肠杆菌DNA多聚酶I，50nmol/L生物素-14-dUTP，50nmol/LdATP,50nmol/LdGTP,50nmol/LdCTP），37℃反应60分钟。用冷PBS洗涤细胞2次，悬浮于0.1ml预冷的1％BSA-PBS中。

4．加入10μl抗生素蛋白-PE，4℃30分钟，用冷PBS洗涤细胞。

5．上样于FACS仪，用FACScanLysisⅡ软件分析。可以同时了解调亡细胞的类型。

2）末端脱氧核苷酸转移酶检测法检测裂解的DNA片段

1．在37℃，含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，用促调亡物质喜树碱处理人PBMC4小时。或用10^－5g/ml地塞米松处理小鼠胸腺细胞4小时。

2．取10⁶经处理的细胞，用1％BSA-PBS洗涤细胞后加入0.1mlFITC标记的抗CD或抗CD8单克隆抗体，4℃20分钟。用冷1％BSA-PBS洗涤细胞2次。置冰上，加入0.1ml1％多聚甲醛，4℃15分钟。用冷PBS洗涤细胞2次，加入冷70％（v/v）乙醇溶液，轻轻悬浮细胞，－20℃固定细胞24小时。4℃离心500×g10分钟，去上清液。

3．用PBS洗涤细胞2次。加入50μlTdT反应液悬浮细胞，37℃反应30分钟。用PBS洗涤细胞2次，悬浮于0.1mlPBS中。

4．加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC，室温反应30分钟，用PBS洗涤细胞。

5．上样于FACS仪，分析调亡细胞的类型和调亡情况。

3）7-AAD染色法

1．取5×10⁵经不同处理的细胞，用PBS洗涤细胞1次，加入10倍量PBS，离心500×g5分钟，去上清液。

2．用0.5ml含20μg/ml7-ADD的PBS悬浮细胞，4℃避光放置20分钟。

3．直接在FACS上用650nm滤光片检测红色荧光，用LysisⅡ软件分析，可区分活细胞（R1）、早期调亡的细胞（R2）和后期调亡细胞/死细胞（R3）。

4）PI染色法

1．取2.5×10⁵～3.5×10⁵经不同处理的细胞，接种在24孔细胞培养板的各孔中，在37℃5％CO₂饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时。

2．每孔加50ml100mg/mlPI。直接在FACS上用FL2滤光片检测红色荧光，用LysisⅡ软件分析，可区分活细胞（R1，不着染）和死细胞（R2，着染）。

5）AnnexinV、7-AAD（或PI）联合染色法

1．配制10倍浓缩的结合缓冲液：含140mmol/LNaCl,25mmol/LCaCl₂的0.1mol/LpH7.0Hepes/NaOH缓冲液，4℃保存，用前用双蒸水稀释10倍。

2．用预冷的PBS洗涤经不同处理的待测细胞，洗2次。用结合缓冲液将细胞配制1×10⁶/ml。取0.1ml细胞悬液置5ml培养管中。

3．加入5μlAV-FITC，再加5μl7-ADD或10μlPI。稍稍混悬细胞，置暗处，室温（20～25℃）15分钟。

4．立即加入0.4ml结合缓冲液，终止反应。立即在FACS上分析。注意设立对照：未经处理的细胞对照，排除自发调亡；不加染色剂的对照；只加AV的对照；只加7-ADD或PI的对照等。

6）溴乙啶/吖啶橙染色法

1．用细胞培养液将经不同处理的细胞配成5×10⁶/ml。向25μl细胞悬液中加1μl溴乙啶/吖啶橙染液。室温中染色适当时间。

2．在荧光显微镜的高倍镜下计数活细胞和有异常染色质分布的细胞。吖啶橙着染经理调亡的细胞核，溴乙啶染色死亡的细胞，活细胞不被染色。