一般情况下哺乳动物细胞摄取并表达外源基因的效率很低，科学家们因此开发了转染技术来克服这个障碍。然而并不是每次转染都能成功，转染成功率可以说已经成为了限制性的瓶颈问题，如何提高转染成功率？如何抓住转染成功的关键？看看罗氏的专家怎么说？

   在通常情况下，哺乳细胞摄取并表达外源基因的效率很低，这主要是由于真核细胞的脂质双层膜是阻止带电荷分子进入细胞的巨大障碍。目前人们已开发了数种转染技术来克服这个障碍。有了这些技术后，采用DNA或RNA转染的方法来研究培养细胞中的基因表达就成为了生物学研究中的常规手段。

   简而言之，转染是指将DNA、RNA、蛋白质或者其他大分子输送进入真核细胞内。使用转染技术的目的包括对基因调节以及蛋白质的表达和功能等进行研究。

现已建立并完善了数种不同的技术将各种分子，尤其是核酸输送进入真核细胞内。这些转染技术是基于三种不同的策略来实现的。

没有一种转染试剂是可以普遍适用的 
  
   并不是所有的转染技术都能适用于所有类型的细胞或实验。采用不同的转染技术在所能获得的基因表达水平方面差异很大。

此外，没有一种单一的技术能够适合于转染实验所用不同细胞体系的多样性。每种转染技术都会有其自身的优点和缺点，而取决因素则包括，例如，需要转染的细胞类型（对于不同的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），或者甚至是对转染应用高通量的要求等都会有所影响。但无论在何种情况下，转染成功都取决于转染效率、低细胞毒性、以及重现性这几个要素。为确保转染的高效性，您需要选择一种可靠的转染技术及转染试剂，使之在您的细胞培养条件下能够发挥最佳效果。

   为了选择最符合您需要的转染试剂，您需要检索有关您所需的特定细胞类型或使用方式的现有文献资料，考察不同试剂的特点并且，如果可能的话，还要采用有关试剂所推荐的方案对几种不同的试剂进行测试。

针对特定使用方式的注意点

细胞生理

为了研究细胞生理，或用细胞进行目标验证，要注意确保所使用的转染过程本身不会改变研究目标的效应途径，或者如果有所改变的话，其改变程度也应尽量减小。如果您所用的转染试剂对细胞有害，那么就很难区分所产生的效应到底是出自转染过程本身还是被转染的特定基因。正因为这个原因，一定要同时转染空载体或含有无关基因的载体作为空白对照。仅有如此您才能对目标基因所产生的效应做出评价。

在进行转染时，您总是希望能获得最佳的转染效率，并且尽量减小相差显微镜下可见的细胞形态学变化。在使用我们的两种转染试剂FuGENE®6和FuGENE®HD对细胞进行的转染研究中，我们采用了微阵列分析方法，来确定基因表达上调或者下降的数量。结果发现我们的这些试剂和其他同类试剂相比较，对试验细胞所产生的非目标效应要少许多。

使用瞬时转染来生产蛋白

以往为了获得蛋白质的高表达产量，您必须先转染细胞，然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间，这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。如果是因为转染试剂具有细胞毒性，那么只有少数细胞能够存活，从而导致蛋白质的产量很低。而如果是因为转染成功的细胞太少，那么那些未转染的细胞其生长速度大大超过转染成功的细胞，其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。

现在，为了获得蛋白质高表达，您有了一个更好的选择，即使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂。使用FuGENE®HD转染试剂，您可以在转染后3-7天获得高产量的蛋白质，因为这种转染试剂几乎没有细胞毒性，可以转染大多数的细胞，并且每种能被转染的细胞都能获得高产量。

但仍有一些蛋白能获得比其他蛋白更高的产量。因此，现将一些影响到蛋白表达高水平的关键因素分列如下：

细胞系（有些类型的细胞比其他细胞产量高） 
质粒骨架（例如：增强子，启动子，转录调控元件） 
目标蛋白（有些蛋白很难获得高表达量）
目标蛋白的CDNA序列（例如：密码子的优化）
培养条件（营养物，代谢废物，转染抑制物）

当这些因素都得到优化，并加入合适配比和数量的转染复合物（转染试剂－质粒）后，就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。

瞬时转染和稳定转染的比较

制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目标基因的载体。选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。

一旦选好了质粒载体，无论短暂或者稳定表达都采用一样的转染方法。被转染的细胞至少要在标准培养基中培养一夜，直到加入选择性试剂。这样就使细胞有时间表达足量