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CHO细胞的稳定转染与基因表达
1、pCDNA3.1+-gD的线性化:pcDNA3.1+使用说明书推荐了以下几个酶作为线性化酶(BglⅡMfeⅡBst1107ⅠEam1105ⅠPvuⅠScaⅠSspⅠ),通过DNAMAN分析gD序列发现其带有MfeⅡ酶切位点。
2、转染前一天,在60mm的dish中接种8×105个细胞,加入5ml培养基(含血清,不含抗生素),37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。
3、通过分光光度计测定pcDNA3.1+-gD的浓度,用不含血清、抗生素、蛋白质的培养基稀释2.5ug的pcDNA3.1+-gD至总体积150ul,其最小浓度不低于0.1ug/ul,稀释后应颠倒几次EP管以混匀混合物。
4、向混匀的混合物中加入15ul转染试剂(PolyFectTransfectionReagentQiagen),用加样器吹打5次。
6、在室温下(20-25℃)孵育混合物5-10分钟。
7、在孵育的同时,吸出dish中的培养基,用PBS液洗涤一次,加入3ml的培养基(含血清,不含抗生素)。
8、孵育完成后加入1ml培养基(含血清),用加样器吹打2次,将产物全部加入60mm的dish中,轻轻摇动dish以混匀。
9、37℃,5%CO2培养,在细胞汇合度不超过50%时加入G418进行筛选。
转染时转染两组细胞,组一在转染后细胞汇合度不超过50%时(一般是24小时)加入G418进行筛选;组二在转染后待细胞汇合度达到80%时1/4000、1/1000、1/300分别接种于dish中,48小时后加G418筛选。
10、加入G418后,每3天更换一次含有筛选浓度的G418。当有大量细胞死亡(5-7天)时,可以把G418的浓度减半维持筛选(此时可以加入适应性培养基1:4来改善细胞对培养基的同化作用)。
11、筛选10-14天后,可见有抗性的克隆出现,停药培养,待其逐渐增大后,制备细胞悬液,记数,用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔,再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入48孔板中增殖(为了减少实验失误带来的风险建议冻存部分增殖细胞)。
12、细胞大量扩增后,提取总DNA,做PCR检测目的基因是否存在。
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