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Preparation of Affinity Column
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PreparationofAffinityColumn
- Add222.2ul1MMOPS,pH7.5to2mLof10mgofCREBtide(0.1MMOPSpH7.5finalconcentration).
- ReadOD205,OD280(using0.1MMOPSbufferasblank)
- Affigel-10isstoredfrozenat<-70¼C.Thawat4¼Cfor~20min.
- Filter1-2mLonnylon(0.22uMporesize),usingBuchnerfunnelandvacuum.Donotallowbeadstodry.
- Washbedwith3x2mLdH2O.
- Scrape0.5-1mLinto15mLmicrofugetube.
- Add2.22mlCREBtideligandsolutiontotube.Rockat4¼Cfor4hrs.
- Transferslurrytocolumn.
- Wash2x500uLdH2O.
- Collecteluateandsaveat-20¼C.ReadOD.
- Washcolumn:
- 2x5mLcoldPBS
- 1x5mLPBS/0.02%NaN3(1uLNaN3in5mLPBS)
- Storeat4¼CuprightinbeakerinPBS/NaN3+Parafilm.
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