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前段时间有个同学因为细胞状态不好,培养基里有小黑点,怀疑是支原体污染。于是检测了一下,果真是的,就买了支原体清除剂。别说效果还真好,3天后细胞状态就好了。
既然细胞状态好了,就停用了,没想到一停用,细胞状态就又差了。把培养箱、细胞房都清理一遍还是不行,就问到了我,既然这些因素都排除了,最后只有一个可能了,刚买的Gibco的胎牛血清,本来心里还想,同学实验室真是土豪啊,我就问了价格,南美胎牛1500……澳州胎牛血清3000……,简直惊讶到了,现在Gibco的血清简直是一货难求,澳州胎牛血清已经炒到了8000+了。
就断定这个血清肯定是假的,用检测试剂盒检测了一下,果然是这个问题,假血清真是害人啊,这些无良奸商……由于支原体比较小,滤器过滤不掉,所以大家买血清的时候一定要先试用,检测一下支原体(现在好多大牌子都会有支原体检测报告)
这里来分享一下支原体检测方法:
1,PCR检测法。
2支原体检测跑胶图-20084539882.jpg
这个Primers是依据支原体基因组中高度保守的16SrRNA编码域而设计的,只需简单的PCR反应就可检测M.Arginini,M.Fermentans,M.Hyorhinis,M.Orale,M.Salivarium,M.Hominis,M.Pneumonia等常见的支原体。
2,DNA萤光染色法
利用萤光染剂(bisbenzimide,Hoechst33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。
Cell+细胞卫士__MycoTestKit(支原体检测试剂盒):
支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。
MycoTestKit是利用降落聚合酶链式反应技术(TD-PCR)对支原体16SrRNA基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。该方法灵敏度高,特异性强,可用于各种生物材料(如细胞培养基、实验动物分泌物、动物血清等)支原体感染的检测。
Cell+细胞卫士__NocardTreatment(支原体清除剂):
(1)推荐NocardTreatment的稀释比例为1:1000,例如:1mL培养基加入1μL的NocardTreatment;
(2)弃去旧的培养基,用PBS将细胞清洗干净,再加入新鲜的含有NocardTreatment的培养基,1天1次,连续处理3-6天。
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回复:时间:2021-08-04
现在的确是这样不仅Gibco而且hyclone市面上几乎都是假货,建议大家不要用了,现在还有一些其他牌子的比如clark还有德国PE还是什么的我忘记了。现在的试剂商心知肚明,真希望国家有一天食品无毒商品无假!感觉hoechst33342更简单便宜,染色十分钟,洗去后上荧光显微镜即可。为楼主赞一下!!!多思考方可进步!
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回复:时间:2021-08-04
杨阳hysno1现在的确是这样不仅Gibco而且hyclone市面上几乎都是假货,建议大家不要用了,现在还有一些其他牌子的比如clark还有德国PE还是什么的我忘记了。现在的试剂商心知肚明,真希望国家有一天食品无毒商品无假!感觉hoechst33342更简单便宜,染色十分钟,洗去后上荧光显微镜即可。为楼主赞一下!!!多思考方可进步!恩恩,染色是最方便的了
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回复:时间:2021-08-04
杨阳hysno1现在的确是这样不仅Gibco而且hyclone市面上几乎都是假货,建议大家不要用了,现在还有一些其他牌子的比如clark还有德国PE还是什么的我忘记了。现在的试剂商心知肚明,真希望国家有一天食品无毒商品无假!感觉hoechst33342更简单便宜,染色十分钟,洗去后上荧光显微镜即可。为楼主赞一下!!!多思考方可进步!请问染色价格贵吗
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回复:时间:2021-08-06
支原体生长缓慢,国标检测支原体采用的平板法需要30天才能出结果,这是生产上使用的方法,做实验的没有人耗得起这个时间。染色法我之前也用过,需要污染后过几天才能检测到,有漏检的状况发生。支原体少量存在,同样对细胞有害,细胞肯定干不过支原体啊。我用过clarkbio的一步法支原体检测试剂盒,只需要加1ul细胞培养上清到反应管里面,60度60分钟水浴后直接根据颜色判断结果,是最为方便的检测方法了,灵敏度比PCR高,价格还可以接受。PCR做完还要跑胶,接触EB,估计要几个小时,步骤一堆,挺麻烦的,功夫钱比试剂贵多了。文献上的PCR检测支原体需要简并引物,并且是多条,自己合成会造成假阴性,损失巨大啊。clontech和Invitrogen的支原体检测试剂盒都是槽式PCR,灵敏度跟clarkbio差不多,死贵,任性的可以。
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回复:时间:2021-08-04
楼主,你培养基里的小黑点什么样的?我昨天刚复苏了一支细胞,低倍镜下看有很多小黑点,高倍镜下看却是有些是线状的,我不知道是不是支原体污染,求楼主帮我看看,如果是一样的情况我也去买支原体去除剂
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回复:时间:2021-08-03
manyulin2001请各位帮助鉴定你这个是支原体污染,不信的话你可以针对支原体16sRNA这个保守区设计一对引物,跑个PCR验证一下,也可以用一下剪刀手生物的支原体清除剂试一下,效果很好的,第二天细胞状态基本上就恢复了
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