培养基

内皮细胞培养步骤

1..培养人脐静脉内皮细胞:1材料与方法1.1材料1.1.1新生儿脐带由重庆医科大学附属第一医院提供。在无菌条件下,于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。长度>20cm,两端扎紧投入到4℃脐带保存液中,1h内送细胞培养室。1.1.2仪器与试剂倒置相差显微镜(日本Olympus公司);超净工作台(苏州净化仪器厂);5%C02培养箱(美国Heraeus公司);离心机(上海安亭仪器厂);25cm2培养瓶、六孔培养板(美国CA)star公司);胎牛血清(美国Gibco公司);促内皮细胞生长添加物(ECGS)、M199培养基、I型胶原酶(美国Sigrna公司);明胶、胰酶(美国A1Tlresco公司);灭菌生理盐水(锦州医学院附属第一医院制剂室);鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体、辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1.2方法1.2.1试剂配制:(1)脐带保存液:生理盐水、葡萄糖100mmoL/L、100U/ml青霉素一100U/m1链霉素。(2)磷酸盐缓冲液(PBs)。(3)D—Hanks液。(4)0.1%I型胶原酶:用PBS配制。(5)0.05%胰酶一0.02%乙二胺四乙酸二钠盐(ED—TA)溶液:用D—Hanks液配制。Devil内皮细胞培养液:含20%胎牛血清、ECGS、肝素,100U/m1青霉素一100U/m1链霉素的M199培养基。(7)0.2%明胶:用PBS配制。以上试剂均过滤除菌。1.2.2人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养:参照Jaffe和LinS等方法并加以改进。在无菌条件下取新生胎儿脐带,长度>20cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分,尽量挤干净脐带内血液。用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。用输血器内接有穿刺器的软管,找到脐静脉,将软管针头一端插入脐静脉,用止水夹固定,另一端接20m1注射器,吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止;将脐带另一端用止血钳夹闭,向脐静脉中灌入0.1%I型胶原酶溶液,使之充盈,夹闭软管,37℃水浴中孵育20min,其间轻轻挤压并旋转脐带,以使酶溶液充分接触血管内壁,然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉,一并收集于小三角瓶中,将细胞悬液装入10ml离心管,1000r/min离心10min,弃上清,吹打悬浮,再次离心10min,重悬细胞并接种于铺有明胶的25cm2培养瓶中,置于37℃5%C02饱和湿度培养箱中培养,24h后更换培养液,以后每隔2d换液1次。1.2.3人脐静脉内皮细胞的传代培养当原代细胞融合80%以上后,加入0.05%胰蛋白酶一0.02%EDTA溶液消化,倒置显微镜下观察,当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液,加入细胞培养液终止消化,收集细胞悬液。1000r/min离心10min,弃上清,制成单细胞悬液。此时可用0.5%台盼蓝染色,计算活细胞百分率,并以血细胞计数板计数。调整细胞浓度为1×10个/ml,接种于培养瓶或培养板中继续培养。待细胞长满,彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。

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