准备工作：DF12加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；DNaseI100*;PI：50ug/ml;Hoechst33342:1000ug/ml（allfromSigma）计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）染色方案：①细胞染色：细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50umol/ml；37℃避光水浴90min；冰上10min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNaseI；上机前再加入PI使终浓度为2ug/ml.并且400滤网过滤细胞②流式细胞仪检测：355nmUV激发光源，610nm双色短通反射滤镜，450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号.测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以HoechstRed为X轴，HoechstBlue为Y轴作二维散点图，将低HoechstRed及低HoechstBlue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比.分选出SP细胞及NonSP细胞.goodell的sp分选http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：Hoechst33342CellStainingandSidePopulationPurificationProtocol(seeGoodell,M.,etal.(1996)JExpMed183,1797-806)TheABIlitytodiscriminateHoechstSPcellsisbasedonthedifferentialeffluxofHoechst33342byamulti-drug-liketransporter.ThisisanactiveBIOLOGicalprocess.Therefore,optimalresolutionoftheprofileisobtainedwithgreatattentiontostainingconditions.TheHoechstconcentration,stainingtime,andstainingtemperatureareallCRITICAL.Likewise,whenthestainingprocessisover,thecellsshouldbemaintainedat4°Cinordertoprohibitfurtherdyeefflux.1)Ensurethatawaterbathispreciselyat37°C.Themediumneedstobeprewarmedbeforehand.2)Tothawcellsfromthecryovials,putthemdirectlyfromdryiceintothe37°Cwaterbath.Oncethecellsarethawed,washthemoncebytransferingthemtoacentrifugetube,adding9mlsoftheirrespectivemedia,andspinningfor5minutesat1200rpminordertoremovethecryo-preservants.3)ResUSPendat106cellspermlinpre-warmedDMEM+5%FBS.Mixwell.4)AddHoechsttoafinalconcentrationof5µg/ml(a200xdilutionofthestock).5)Mixthecellswell,andplaceinthe37°Cwaterbathfor90minutesexactly.Makesurethestainingtubesarewellsubmergedinthebathwatertoensurethatthetemperatureofthecellsismaintainedat37°C.Tubesshouldbemixedseveraltimesduringincubation.6)After90minutes,spinthecellsdownintheCOLDandresuspendinCOLDPhosphateBufferedSaline(PBS).7)Allfurtherproceedingsshouldbecarriedoutat4°CtoprohibitleakageoftheHoechstdye.Add2µg/mlof7-AADtothesuspendedcells(a100Xdilutionofthestockprovided)andmixabout5minutesbeforeFACSanalysis.Thiswillallowforthediscriminationofdeadversuslivecellsas7-AADpermeatesonlycellsthatdonothaveanintactmembrane.这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。一Hoechst染色方案1.在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。2.重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。3加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200的原液(1mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261,Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃4将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90min的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。5Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排,绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。6抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。7当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入2μg/mlPI以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。8试剂DMEM+：高糖DMEM(CatNo.11965‐092,GibcoInvitrogen)Penicillin/streptomycin(CatNo.15140‐122,GibcoInvitrogen)10mMHEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）(CatNo.15630‐080,GibcoInvitrogen)2%Fetalbovineserum/fetalcalfserumHBSS+：Hank’s平衡盐溶液(Cat.No.14170‐112,GibcoInvitrogen)10mMHEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）(CatNo.15630‐080,GibcoInvitrogen)2%Fetalbovineserum/fetalcalfserumHoechst33342粉(Cat.No.B2261,Sigma)：200×原液(1mg/ml)的制备，将Hoechst33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中，Sigma公司的Hoechst33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。（PI）Propidiumiodide(Cat.No.P‐4170,Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。二Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案1Hoechst染色结束后，重悬细胞于1×108cells/ml　冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）2用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。3用磁珠小体标记细胞，从MiltenyiBiotech(Cat.No.130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20%体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。4用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。5重悬细胞于2×108cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。三HoechstSP细胞的流式细胞仪分析1Hoechst33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst33342染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpsonetal.,2006)。Hoechst在350nm波长被激发，另外的激光如激发FITC和PE的488激光可以用来激发其他的荧光染料。2Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：HoechstBlue和HoechstRed。HoechstBlue用450/20滤光片测量，HoechstRed用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较HoechstRed信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。还有，一种高能的紫外激光(50–100mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。3流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为HoechstBLUE对RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分G0–G1及S–G2–Mcells在右上方。为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65—95%会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。4操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒(DNAcheckbeads,Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。5好的SP染色的证实（1）共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。（2）用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。

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