HepatocyteIsolationSystemSource:N/AKitforperformingfiveseparateadultratliverperfusions.ContainsfivesingleuseCLSHenzymevials,fivesingleuseDNasevials,10XCMF-Hank"sBalancedSaltSolution,L-15MediaPowder,0.15MMOPSbuffer,7.5%SodiumBicarbonateSolution,andoptimizedprotocol.Thekitisuse-testedbyWorthingtontoassureperformance.Storeat2-8°C.

MosttrADItionalmethodspublishedforisolatinghepatocytesusecrudeandpartiallypurifiedenzymepreparationsincludingvarioustypesofCollagenaseandotherproteases.MorerecentlytheuseofbettercharacterizedpreparationsofcollagenasesuchasWorthingtonTypes1and4(CLS-1,4)haveprovidedbetterresults.Allcrudecollagenasepreparationscancontainlot-variablecontaminatingproteases,esterasesandotherenzymesrequiringresearcherstopre-screenseverallotsofenzymeand/orcontinuallymodifyisolationparametersandprotocols.

TheWorthingtonHepatocyteIsolationSystemhasbeendevelopedtoprovideresearcherswithareliable,convenient,andconsistenthepatocytecellisolationsystem.Byusingthepre-optimizedcombinationofenzymescontainedinthiskit,itispossIBLetominimizethelot-to-lotvariationandimprovethequalityoftheisolatedhepatocytes.Inaddition,Worthingtonuse-testseachlotbyisolatinghepatocytesfromadultrattoassureperformance,reliABIlity,andconsistentyieldofviablecells.

ThemethodisbasedonthatdescribedbyBerry,M.N.,modifiedbySeglen,P.O.(MethodsinCellBIOLOGy,volXIII,DavidM.Prescotted.,AcademicPress,1976;Chapter4,"PreparationofIsolatedRatLiverCells",pp29-83),andfurtheroptimizedinconjunctionwithseveralresearchers.

Stability/Storage:Thereagentsarestableatambienttemperaturesfortheperiodsoftimeexpectedinnormalshippingprocedures,butthepackageshouldberefrigerateduponarrival.Contentsmaybestoredat2-8°Cfor4-6monthsbeforeuse.Storeat2-8°C.

PackageContentsThepackagecontainssufficientmaterialsforfiveseparateadultratliverperfusions.Forlargerorsmallertissueapplications,prepareproportionatevolumesofreagentsateachstepandcombinetheminthesameratioasdescribedintheprotocol.

Vial#1:10XCMF-HBSSConcentrate,1bottle,500mlSterilecalcium-andmagnesium-freeHank"sBalancedSaltSolution(CMF-HBSS).Thesolutionisusedforwashingandperfusingtheliverpriortotheadditionofthedissociatingenzymesolution.

Vial#2:22,500UnitsCollagenaseand30UnitsElastase,5VialsWorthingtoncollagenase(Code:CLS-1)andelastase(Code:ESL),filteredthrough0.22µmporesizemembrane,andlyophilized.Beforeuse,reconstitutewiththeL-15/MOPSsolutionandswirlgentlytodissolvecontentsasdirectedinthefollowingprocedure.Storeunreconstitutedvialsat2–8°C.

Vial#3:1,000UnitsDNaseIeach,5VialsWorthingtonDNaseI(Code:D),filteredthrough0.22µmporesizemembrane,andlyophilized.Beforeuse,reconstitutewithL-15/MOPSsolutionandswirlgentlytodissolvecontentsasdirectedinthefollowingprocedure.Storeunreconstitutedvialsat2–8°C.

Vial#4:0.15MMOPS,pH7.5,1bottle,75ml0.15MMOPS,pH7.5bufferconcentrate,usedtobufferthereconstitutedLeibovitzL-15media.Vial#5:7.5%SodiumBicarbonate(NaHCO3),1bottle,100ml7.5%Sodiumbicarbonateconcentrate,usedtobufferthedilutedCMF-HBSS.

Pouch,containingLeibovitzL-15MediaPowder,1x1LReconstituteentirecontentsofpouchbycuttingopentopofenvelopeandpouringcontentsintobeakercontainingapproximately800mlofcellculturegradewater.Rinsepouch2-3timeswithanadditional100mlwater.Bringtotalvolumeto1000mlandfilterthrougha0.22micronporesizemembrane.

References

Alpinietal.,"RecentAdvancesintheIsolationofLiverCells",Hepatology(1994)20:494-514.

Berry,M.N.,Edwards,A.M.,andBarritt,G.J.;IsolatedHepatocytes:Preparation,PropertiesandApplications,RHBurdonandPHVanKnippenberg,eds.,Elsevier,Amsterdam,NewYork,Oxford,Chapt.2,1991.

ChenH-L,WuH-l,FonC-C,ChenP-J,Lai,M-Y,ChenD-S(1998)Long-termcultureofhepatocytesfromhumanadults.BiomedicalScience5:435-440

DeRobertis,E.D.P.,Saez,F.A.andDeRobertis,E.M.F.:CellBiology,6thed.,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,PA,1975.

Freshney,R.Ian:CultureofAnimalCells,AlanR.Liss,Inc.,NewYork,2000.

Hanks,J.H.,andWallace,R.E.:Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,71,1961949.

Jakoby,W.B.,andPastan,I.H.:MethodsinEnzymologyVol.LVIIIp.121,AcademicPress,1979.

LeCluyseEL(2001)HumanhepatocytesystemsfortheinvitroevaluationofcytochromeP450enzymeexpressionandregulation.Eur.JPharmSci13:343-368.

LeCluyseEL,PLBullock,AParkinson(1996)Strategiesforrestorationandmaintenanceofnormalhepaticstructureandfunctioninlong-termculturesofrathepatocytes.Adv.DrugDelRev22:133-186.

Leibovitz,A.:TheGrowthandMaintenanceofTissue/CellCulturesinFreeGasExchangewiththeAtmosphere,Am.J.Hyg.,78,173,1963.

Seglen,P.O.,MethodsinCellBiology,Vol.XIII,DavidM.Prescotted.,Ch.4,pp.29-83,AcademicPress,1976.

WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ,1993.

WorthingtonTissueDissociationGuide,WorthingtonBiochemicalCorp.,Lakewood,NJ,2003. 

RelatedProducts:

Collagenase(CLS1-4/CLSPA)
DeoxyribonucleaseI(DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF)
Elastase(ES/ESL)
Hyaluronidase(HSE/HSEP)
NeutralProtease(Dispase,NPRO)
Papain(PAP/PAPL/PAP2)
ProteinaseK(PROK)
Trypsin(TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK)
TrypsinInhibitors(LBI/OI/SI/SIC)

CellIsolationOptimizimgSystem(CIT)
NeonatalCardiomyocyteIsolationSystem(NCIS)
PapainDissociiationSystem(PDS/PDS2)

Worthington胰蛋白酶IUB：3.4.21.4CAS：9002-07-7 酶促反应 （图像将在新窗口中打开） 胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，具有基于带正电荷的赖氨酸和精氨酸侧链的底物特异性（Brown and Wold 1973）。该酶经胰腺排泄，并参与食物蛋白质的消化和其他生物过程。胰蛋白酶是一种中等大小的球状蛋白，是一种无活性的酶，即胰蛋白酶原（Chen等， 2009）。历史：1876年，胰蛋白酶由Kuhne首次命名，他描述了该胰酶的蛋白水解活性。他比较了胰蛋白酶和胃蛋白酶，发现差异因素是最佳pH。1931年，诺斯罗普（Northrop）和库尼兹（Kunitz）在1930年首次纯化胃蛋白酶后不久，通过结晶纯化了胰蛋白酶。1974年，确定了三维结构，将其作为胰蛋白酶所属的丝氨酸内肽酶S1家族的原型。在1980年代末期和1990年代初，重组胰蛋白酶的定点诱变确定了特定氨基酸残基的作用（Sprang等， 1987； McGrath等， 1989； Corey和Craik 1992，以及Corey等1992）。 在1990年代后期，研究了胰蛋白酶在遗传性胰腺炎中的作用，并确定Arg117His处的突变可防止自溶，从而引起胰腺炎。 如今，胰蛋白酶继续用于细胞和组织培养方案的开发（Soleimani等， 2009； Banumathi等， 2009； Yang等， 2009），以及通过肽测序技术进行蛋白质鉴定（Manz等，2009）。（ 2004年和Schuchert等人， 2009年）。在医学领域，胰蛋白酶在包括囊性纤维化（Tzetis等， 2007； Li等， 2009）和慢性胰腺炎（Chen等， 2009）在内的胰腺疾病中的作用已成为当前研究的主题，并且胰蛋白酶已被用于模拟骨关节炎中关节软骨的分解（Wang等， 2008）。特异性：胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C-末端切割肽。如果脯氨酸残基在切割位点的羧基侧，则不会发生切割。如果酸性残基在切割位点的任一侧，则水解速度已显示出较慢。组成：胰蛋白酶原可通过去除末端六肽而活化以产生单链β-胰蛋白酶。随后的有限自溶作用产生了具有两个或多个被二硫键结合的肽链的其他活性形式。主要形式是α-胰蛋白酶，具有两条肽链和β-（一条链）。α-和β-胰蛋白酶显示出不同的活性和热稳定性。 其他结构特征包括在氨基酸185-193处的表面环，尽管不与底物直接接触，但仍会影响特异性。稳定性需要高亲和力的Ca2 +结合位点，如果不存在，则会发生自溶。自溶环（位于氨基酸143-151）在胰蛋白酶和胰蛋白酶原中都非常灵活。在赖氨酸上的裂解产生保留一些催化活性的α形式。该蛋白质具有六个完全保守的二硫键（Halfon和Craik 1998）。分子特性：牛胰腺表达两种形式的胰蛋白酶，主要的阳离子形式和次要的阴离子形式。这些蛋白质序列具有72％的同一性，而它们的编码区具有78％的同一性。 这些蛋白质中的每一个都进一步加工成其他形式。催化胰蛋白酶包含一个灵活的“自溶环”（残基G145-V157）（Schroeder和Shaw 1968，以及Bartunik等人1989），并且在该环中，主要的单链形式B-胰蛋白酶在K148-S149处自溶。形成A-胰蛋白酶。K193-D194的进一步自溶作用导致Psi-胰蛋白酶的形成（Fehlhammer和Bode 1975）。阳离子和阴离子胰蛋白酶均表达为胰蛋白酶原酶，具有15个残基的信号肽（M1-A15）和8个残基的前肽（F16-K23）。所有已知胰蛋白酶的三维折叠都是高度保守的。另外，催化三联体和催化三联体侧翼的区域是高度保守的（Hartley 1970）。  蛋白质登录号： P00760CATH分类（v。3.2.0）： 类：主要是Beta建筑：Beta桶拓扑：凝血酶，H亚基分子量：  23.3 kDa（理论值）最佳pH值：  7.5-8.5（Koutsopoulos等， 2007）等电点：胰蛋白酶原：pH 9.3（Walsh and Neurath 1964）胰蛋白酶：pH 10.5（坎宁安1954）。消光系数： 胰蛋白酶原：45,250 cm -1  M -1 >活动站点残留：组氨酸（H63）天冬氨酸（D107）丝氨酸（S200）活化剂： 使用镧系元素代替钙离子可提高胰蛋白酶原转化率（Gomez等， 1974）。抑制剂：胰，大豆，利马豆和蛋清胰蛋白酶抑制剂（请参阅胰蛋白酶抑制剂部分）DFP广告管理系统抑肽酶银+苄amEDTA         （White and White 1997）应用范围：组织解离，尤其是与其他酶（例如胶原酶和弹性蛋白酶）结合使用时通过“胰蛋白酶消化”收集细胞线粒体隔离蛋白质的体外研究从塑料和玻璃上去除单层细胞各种血凝程序用于流式细胞仪DNA分析的样品制备胰蛋白酶映射指纹和测序工作环境监测组织培养中细胞密度的降低传代细胞切割融合蛋白从纯化的糖蛋白中生成糖肽 （White and White 1997）