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逆转录酶的发现及酶活性

mayitao /发布时间:1627752602 /浏览量:164

逆转录酶（ReverseTranscriptase），又称反转录酶或反向转录酶，是一类以单链RNA为模板合成DNA的一种酶，合成方向是5′→3′延伸，需要4种脱氧核苷酸及引物，因此也称为核糖核酸依赖性聚合酶，RNA指导的DNA聚合酶或依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependentDNApolymerase，RDDP）。逆转录酶是1970年美国科学家特明(H.M.Temin)和巴尔的摩(D.Baltimore)分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们因此获得了1975年度诺贝尔生理学或医学奖。目前发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有逆转录酶。目前商品化的逆转录酶有AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶，另外来自嗜热微生物的热稳定性逆转录酶以及MMLV逆转录酶（RNaseH-）突变体（商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ）。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。

大多数逆转录酶具有多种酶活性，主要包括：

（1）DNA聚合酶活性：以单链RNA为模板，利用dNTP以5′→3′方向逆转录合成cDNA，反应需要引物来起始合成，通常逆转录酶不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由逆转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

（2）RNaseH活性：即从由逆转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的RNA-DNA杂合体上降解单链RNA活性。逆转录酶的RNaseH活性在实验室逆转录过程中扮演了双重角色，一方面RNaseH活性会降解RNA模板，影响逆转录产物的长度和产量，不少商品化的逆转录酶特意用突变技术改造酶去除了RNaseH活性以期得到更多全长的逆转录产物，提高产率；另一方面，逆转录反应结束后继的cDNA第二链合成或PCR实验需要借助RNaseH活性以去除反应体系中RNA模板，对于采用去除RNaseH活性的逆转录酶的实验往往需要另外添加RNaseH。

（3）DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。

除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。从组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补DNA(cDNA)（所有合成cDNA第一链的方法都要用逆转录酶来催化反应），由此可构建出cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。如果采用基因特异的引物进行逆转录，然后再用PCR扩增得到特定的DNA，也就是我们通常所说的RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。逆转录酶催化的逆向转录表明遗传信息也可以从RNA传递到DNA，从而导致传统中心法则的修改和补充，并促进了生物化学、分子生物学和病毒学的研究。

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