本发明属于分子生物学
技术领域：
。更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法。
背景技术：
：人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病。主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。为实现HPV的早期检测并使耐药菌传播减至最小，开发低成本、准确、高效、快速地检测HPV相关特异基因的诊断方法非常重要。使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，但是由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性，传统的检测方法耗时并且准确性不高。如(1)分离培养技术：病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体金标准鉴定技术。该方法存在对的问题主要有：分离培养耗时长，往往需要几天时间，无法实现短时间内迅速得到检测结果，且必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-Sanger测序技术、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有HPV检测技术的缺陷和不足，研究发现了一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现高灵敏、高精度的HPV核酸检测。本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点及gRNA组合。本发明另一目的是提供一种HPV基因的CRISPR/Cas12a检测系统。本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测方法。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。所述HPV核酸检测靶标位点的序列如SEQIDNO.1-9任一所示。同时所述靶标位点在作为HPV核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测位点方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。基于上述研究成果，本发明还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。所述gRNA的设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。作为优选的可选择方案，所述gRNA的序列如SEQIDNO.10-16任一所示。该gRNA组合也应在本发明的保护范围之内。同时本发明还提供一种HPV核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA的序列对应于SEQIDNO.1-9任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA的序列如SEQIDNO.10-16任一所示。另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。所述ScCas12a的序列如SEQIDNO.17所示，所述SsCas12a的序列如SEQIDNO.18所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。本发明具有以下有益效果：本发明研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现HPV核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测。同时还能实现多病毒亚型同时检测，临床检测效果优异，对于HPV的检测与筛查具有重要的意义。附图说明图1为LbCas12a对HPV18和HPV16的不同gRNA检测效果。图2为实施例5中对10例人类乳头瘤病毒18型(HPV18)阳性临床样本的检测效果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODSINENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR2:APRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMALCELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。实施例1基于CRISPR/Cas12a系统的HPV18核酸检测位点的发现我们获取HPV18基因组序列，通过生物信息学分析比对，将不同的HPV18分离株中保守区域截取出来。同时通过与其他HPV亚型，如HPV16比对，确认HPV18特异的鉴定区域。经过大量的探索实验，针对不同区域设计gRNA并构建CRISPR/Cas12a系统进行研究。结果表明，以SEQIDNO.1-7任一所示区域序列为基于CRISPR/Cas12a系统的HPV18核酸检测位点，具有很好的检测效果。SEQIDNO.1：gatgacactgaaagttcccatgccgccacgtctAATgtttctgaggacgttagggacaatgtgtctgtagattataagcagacacagttatgtattttgggctgtgcccctgctattggggaacactgggctaaaggcactgcttgtaaatcgcgtcctttaTCACAGGGCGATTGCCCCCCtttaGAACTTAAAAACACAGTTTTggaagatggtgatatggtagatactggatatgGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATttgtcagtctatttgtaaatATCCtgattatttacaaatgtctgcagatccttatggggattccatgtttttttgcttacggcgtgagcagctttttgctaggcatttttggaatagagcaggtactatgggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtgtgtattctcSEQIDNO.2：tttaTCACAGGGCGATTGCCCCCCtttaGAACTTAAAAACACAGTTTTggaagatggtgatatggtagatactggatatggtgccatggacTTTAGTACATTGCAAGATACTAAAtgtgaggtaccattggatatttgtcagtctatttgtaaatatcctgattatttacaaatgtctgcagatccttatggggaSEQIDNO.3：tttaTCACAGGGCGATTGCCCCCCSEQIDNO.4：TTTAGTACATTGCAAGATACTAAASEQIDNO.5：tttacaaatgtctgcagatccttaSEQIDNO.6：CAGTATTGGCAACTAATACGTTGGGAAAATGCAATATTCTTTGCAGCAAGGGAACATGGCATACAGACATTAAACCACCAGGTGGTGCCAGCCTATAACATTTCAAAAAGTAAAGCACATAAAGCTATTGAACTGCAAATGGCCCTACAAGGCCTTGCACAAAGTGCATACAAAACCGAGGATTGGACACTGCAAGACACATGCGAGGAACTATGGAATACAGAACCTACTCACTGCTTTAAAAAAGGTGGCCAAACAGTACAAGTATATTTTGATGGCAACAAAGACAATTGTATGAACTATGTAGCATGGGACAGTGTGTATSEQIDNO.7：AATGCTTACGATACAGATTGCGAAAACATAGCGACCACTATAGAGATATATCATCCACCTGGCATTGGACAGGTGCAGGCAATGAAAAAACAGGAATACTGACTGTAACATACCATAGTGAAACACAAAGAACAAAATTTTTAAATACTGTTGCAATTCCAGATAGTGTACAAATATTGGTGGGATACATGACAATGTAATACATATGCTGTAGTACCAATATGTTATCACTTATTTTTTTATTTTGCTTTTGTGTATGCATGTATGTGTGCTGCCATGTCCCGCTTTTGCCATCTGTCTGTATGTGTGCGTATGCATGGGTAT实施例2基于CRISPR/Cas12a系统的HPV16核酸检测位点的发现我们获取HPV16基因组序列，通过生物信息学分析比对，将不同的HPV16分离株中保守区域截取出来。同时通过与其他HPV亚型，如HPV16比对，确认HPV16特异的鉴定区域。经过大量的探索实验，针对不同区域设计gRNA并构建CRISPR/Cas12a系统进行研究。结果表明，以SEQIDNO.8-9任一所示区域序列为基于CRISPR/Cas12a系统的HPV16核酸检测位点，具有很好的检测效果。SEQIDNO.8：TTTTGTAAATTCTAAAAGCCATTTTTGGTTACAACCATTAGCAGATGCCAAAATAGGTATGTTAGATGATGCTACAGTGCCCTGTTGGAACTATATAGATGACAATTTAAGAAATGCATTGGATGGAAATTTAGTTTCTATGGATGTAAAGCATAGACCATTGGTACAACTAAAATGCCCTCCATTATTAATTACATCTAACATTAATGCTGGTACAGATTCTAGGTGGCCTTATTTACATAATAGATTGGTGGTGTTTACATTTCCTAATGAGTTTCCATTTGACGAAAACGGAAATCCAGTGTATGAGCTTAATGATAAGAASEQIDNO.9：ACTATTACAACAATATTGTTTATATTTACACATTCAAAGTTTAGCATGTTCATGGGGAATGGTTGTGTTACTATTAGTAAGATATAAATGTGGAAAAAATAGAGAAACAATTGAAAAATTGCTGTCTAAACTATTATGTGTGTCTCCAATGTGTATGATGATAGAGCCTCCAAAATTGCGTAGTACAGCAGCAGCATTATATTGGTATAAAACAGGTATATCAAATATTAGTGAAGTGTATGGAGACACGCCAGAATGGATACAAAGACAAACAGTATTACAACATAGTTTTAATGATTGTACATTTGAATTATCACAGATGGT实施例3基于CRISPR/Cas12a系统的HPV核酸检测案例1、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达采用源自Lachnospiraceaebacterium的Cas12a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas12a蛋白基因克隆入带6-His组氨酸标签的pET28a质粒，方便蛋白纯化表达。Cas12a蛋白重组表达载体转化，表达菌采用BL21star(DE3)。具体蛋白表达条件为：在培养菌液OD600＝0.6时加入0.5mMIPTG培养4小时。收集菌体进行蛋白纯化。纯化条件为：将菌体重悬于裂解液(50mMTris,pH8.0，300mMNaCl，5％甘油，20mM咪唑)，进行超声破碎(70％振幅，2sOn/4sOff，3分钟，Sonics750w超声仪)，离心分离上清液，以镍柱纯化，以含250mM咪唑的裂解液洗脱，浓缩洗脱组分，以Superdex200，Tricorn10/300凝胶色谱柱进行纯化。SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白，放-80℃保存。2、制备靶RNA靶核苷酸可经过PCR扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)，NASBA等温扩增、或环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)方式扩增靶DNA。重组酶聚合酶扩增RPA(RecombinasePolymeraseAmplification)：采用NCBIPrimerblast设计RPA引物，扩增片段大小为80-120nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。模版序列为实施例1中SEQIDNO.1所示(来源于HPV18基因组序列)。其中RPA引物包括：gRNA1target1和2(144bp)FP:AAAggCACTgCTTgTAAATCgCgTCCTTTATCRP:ATATCCAgTATCTACCATATCACCATCTTCgRNA3target3(144bp)FP:GGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTARP:ATAGTACCTGCCCTATTCCAAAAATGCCTA分别参考Basic和BasicRT(TwistDx)试剂盒进行RPA反应，不同的是，在模板片段加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁。在37℃下反应30分钟。胶分离以及纯化(采用MinElutegelextractionkit(Qiagen)试剂盒)，纯化后的dsDNA与T7聚合酶37℃孵育过夜(采用T7RNApolymerase(Thermo)试剂盒)，然后用RNeasyminikit(Qiagen)试剂盒纯化RNA，从而获得靶核RNA。3、制备gRNAgRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/在线软件辅助设计。gRNA引物结构：5’-靶向序列-“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”-CCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3’其中“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”序列可替换为“ATCTACAATAGTAGAAATTA”。参照T7RNApolymerasekit(Thermo)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7引物、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再采用RNeasyminikit(Qiagen)，获得纯化的gRNAs。T7引物序列：TGTAATACGACTCACTATAGGGT7gRNA引物序列：“靶向序列”-5’-ATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3’经过大量探索研究，得出了一系列gRNA，序列如SEQIDNO.10-16任一所示：SEQIDNO.10：TAATTTCTACTAAGTGTAGATTCACAGGGCGATTGCCCCCCSEQIDNO.11：TAATTTCTACTAAGTGTAGATGTACATTGCAAGATACTAAASEQIDNO.12：TAATTTCTACTAAGTGTAGACAAATGTCTGCAGATCCTTASEQIDNO.13：TAATTTCTACTAAGTGTAGATTATGCACTTTGTGCAAGGCCSEQIDNO.14：TAATTTCTACTAAGTGTAGATTACACTATCTGGAATTGCAASEQIDNO.15：TAATTTCTACTAAGTGTAGATGTTGTACCAATGGTCTATGCSEQIDNO.16：TAATTTCTACTAAGTGTAGATGAGGCTCTATCATCATACAC4、单重CRISPR/Cas12a病原检测体系的有效性验证检测体系包括：2μlRPA产物，45nM纯化的LbCas12a，22.5nMgRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlertQCSystem,ThermoScientific)，0.5μlRNase抑制剂(Promega)，及核酸酶检测缓冲液(20mMTris,60mMNaCl,10mMMgCl2,pH7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃(除非另有说明)下反应30min，取终末荧光值进行结果判读。分析CRISPR/Cas12a反应荧光数据：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阴性。检测结果如图1所示，结果表明：所述Cas12a蛋白和所设计的gRNA可识别切割靶标位点并产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别相关的病原靶标序列，可用于相关病原的定性检测。5、单重CRISPR/Cas12a检测体系的特异性验证设置3组实验，取3种不同靶标基因的RPA产物，分别选择与其对应的一种gRNA和两种不相关gRNA进行组合反应，验证gRNA序列的特异性。具体操作：选择3种靶标基因(SEQIDNO.1、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7)，取这3种不同靶标基因的RPA产物，分别对3种不同的gRNA(SEQIDNO.10、SEQIDNO.13和SEQIDNO.14)进行上述的CRISPR/Cas12a剪切反应，灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。结果显示：SEQIDNO.1与其对应的gRNA(SEQIDNO.10)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQIDNO.13和SEQIDNO.14)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQIDNO.6与其对应的gRNA(SEQIDNO.13)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQIDNO.10和SEQIDNO.14)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQIDNO.7与其对应的gRNA(SEQIDNO.14)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQIDNO.10和SEQIDNO.13)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。上述结果证明三种病原的靶标序列与gRNA序列互为特异，相对应的gRNA具有良好的特异性。具体结果如表1所示。表1.单重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果反应组合模板gRNA结果组合1SEQIDNO.1SEQIDNO.10(靶标序列为SEQIDNO.1)阳性组合2SEQIDNO.1SEQIDNO.13(靶标序列为SEQIDNO.6)阴性组合3SEQIDNO.1SEQIDNO.14(靶标序列为SEQIDNO.7)阴性组合4SEQIDNO.6SEQIDNO.10(靶标序列为SEQIDNO.1)阴性组合5SEQIDNO.6SEQIDNO.13(靶标序列为SEQIDNO.6)阳性组合6SEQIDNO.6SEQIDNO.14(靶标序列为SEQIDNO.7)阴性组合7SEQIDNO.7SEQIDNO.10(靶标序列为SEQIDNO.1)阴性组合8SEQIDNO.7SEQIDNO.13(靶标序列为SEQIDNO.6)阴性组合9SEQIDNO.7SEQIDNO.14(靶标序列为SEQIDNO.7)阳性实施例4基于CRISPR/Cas12a系统的多重HPV核酸检测方法为了实现对多种病原菌的同时检测，我们开发了针对上述病原靶标的多重检测体系。首先对选择的HPV18、HPV16型两种型别病毒的鉴定区域及对应gRNA序列进行分析，根据这些序列的相似性、GC含量、碱基均一性、有无形成二级发夹结构、同一反应有无交叉反应等因素考虑，对反应体系和gRNA组合方式进行优化。所得检测体系能够实现多病毒同时检测。本实施例呈现了部分实验及结果。1、按照实施例2中步骤3的方法制备好gRNA后，取4种gRNA按等比例混合(SEQIDNO.10、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14和SEQIDNO.15)，然后按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。检测反应中的模板则分别为所选gRNA对应靶标基因的RPA产物，他们是SEQIDNO.1，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。实验中灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。结果分析时去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。实验结果表明，特异性的靶标基因的RPA产物(SEQIDNO.1，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)加入多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性；非特异性的靶标基因的RPA产物(SEQIDNO.9)加入多重gRNA反应体系后，没有荧光产生，结果为阴性；说明实验建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。2、基于以上实验结果，为了同时实现对HPV18和HPV16型两个型别病毒的定性检测，我们对本专利筛选出的靶标基因和gRNA序列进行组合和优化，每种型别病毒挑选2个靶标位点和对应的gRNA进行组合。根据GC含量，无发夹结构，无无交叉反应等原则，优化组合方式。在本实施例中，我们通过计算模拟和实验验证，挑选了以下组合方案。将4种gRNA等比混合，4种gRNA分别为：SEQIDNO.10(靶标序列为SEQIDNO.1)，SEQIDNO.13(靶标序列为SEQIDNO.6)，SEQIDNO.15(靶标序列为SEQIDNO.8)和SEQIDNO.16(靶标序列为SEQIDNO.9)。为了验证上述方案，我们分别使用HPV18和HPV16两个型别病毒的基因组做为模板，验证上述gRNA组合的特异性。按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。实验结果表明，两种病毒的基因组核酸加入上述组合的多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性(表2)。说明针对HPV18和HPV16建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。表2.多重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果本实施例中，我们用病原基因组核酸样本对一种gRNA组合方案进行了验证，运用本专利中列出的gRNA序列进行其他形式组合，都在本专利的保护范围之内。本领域技术人员可以理解的是，可以采用本领域常规的替代方法替换本发明实施例中常规的Cas12a基因的克隆、重组表达载体的构建、Cas12a蛋白的表达及纯化、靶核苷酸/目标基因片段的扩增等步骤中的一种或多种，以期获得类似或等同的效果。实施例5基于CRISPR/Cas12a系统的临床样本检测我们收集了10例宫颈拭子样本，经荧光定量PCR验证均为人类乳头瘤病毒18型(HPV18)阳性。对该批样本进行核酸提取后，利用本发明技术进行CRISPR/Cas12a检测。具体方法：1、核酸处理：使用1ml生理盐水反复清洗拭子，洗脱物采用柱提法提取核酸(口腔拭子基因组提取试剂盒)，用30μl灭菌水溶解核酸产物。2、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达，gRNA制备(SEQIDNO.13)、病原检测体系及荧光检测方法参考上述实施例2，其中阳性对照为合成的靶标基因质粒(SEQIDNO.6)。3、实验结果如图2所示，10例临床样本检测均有荧光产生，为阳性，说明CRISPR/Cas12a系统可成功检测HPV18阳性的临床样本。另外，上文中SEQIDNO.17-SEQIDNO.18序列如下：SEQIDNO.17：(ScCas12a的序列)ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGGAATACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATCTATTTCCGCTCCGGCACCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGTCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGAAAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTCTTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGAAAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACCAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCATCGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCSEQIDNO.18：(SsCas12a的序列)ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGAAGTACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATGTATTTCCGCTCCGGCGCCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGCCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGATAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTTCTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGCCAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACAAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCGTGGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAA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