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姊妹染色单体互换标本制备与分析实验一基本方案
mayitao
/发布时间:1533244741 /浏览量:25
| 实验方法原理 | 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridinc简称BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物。人体淋巴细胞在含有BrdU的培养液中进行DNA复制时，BrdU可专一替代胸腺嘧啶核苷，而掺入到新复制的DNA核苷酸链中。因此只要通过两个复制周期，就可使姊妹染色单体中一条单体的DNA链中，有一股链是掺入BrdU的，而另一条单体的DNA双链，两股链全掺入BrdU。由于双股都含有BrdU的DNA分子构形有变化，使这条染色单体对某些染色剂的亲合力降低，用Giemsa染液染色时就可清楚看到双股都含BrdU的DNA链所组成的单体着色浅，而另一条单体着色深。这样就可利用这一技术检查同一染色体的两条姊妹染色单体互换（SCE）的情况。现已证明，许多致突变剂和致癌物质可诱发姊妹染色单体互换和诱发染色体断裂、重排。对这些因素SCE要比染色体畸变敏感的多。因而检测姊妹染色单体交换频率是检查致癌和致突变剂的细胞生物学效应的一种新方法，它具有灵敏、准确、简便快速的优点。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 人外周血 试剂、试剂盒 | BrdU溶液SSCGiemsa染液PBS 仪器、耗材 | 紫外灯恒温水浴箱培养皿擦镜纸
实验步骤 | 1. 培养液的制备、采血、培养等操作同常规染色体的制备。（见常规染色体标本制备方法） 2. 在外周血培养24小时加入BrdU溶液0.2毫升，使终浓度为每毫升培养液含8微克。加入BrdU后，用黑纸包褒培养瓶，置37℃温箱中继续培养48小时。 3. 秋水仙素处理方法同前（见染色体标本的制备）。 4. 按常规方法收集细胞、固定、低渗、制片，并将标本片置37℃温箱中烘片24小时。 5. 将标本面朝上平放于染色槽中，然后加入2×SSC溶液，以溶液不超过标本表面为度。然后在标本上复盖一张比标本稍大的擦镜纸，使纸边垂到2×SSC溶液中，用以保持标本湿润。 6. 将染色槽置55℃恒温水浴箱中温育，上用30W紫外灯垂直照标本30分钟，灯距标本距离约为10cm。照射后轻轻取掉擦镜纸，立即用蒸馏水冲洗标本。（水温为40℃左右）。 8. 姊妹染色单体互换的镜检分析及频率计算 （1）在正常或异常情况下，姊妹染色单体互换的频率不同。根据上述标本染色单体的明显色差不同，通过计数可较准确检测姊妹染色单体之间的互换频率。 （2）选取染色体分散良好，两条姊妹染色单体染成一深一浅的中期相，凡发生有姊妹染色单体互换的染色体，可见在深染的染色单体上出现浅染的片段。对在染色体端部出现的互换计为一次（一个SCE）；对在染色单体中间出现的互换计为两次（2个SCE）；对在着丝粒部位的，经判明不是两条染色单体发生扭转者，计为一次（1个SCE）。 （3）计数30个中期分裂相的SCE后，计算SCE的频率。 ①SCE频率=n个中期相SCE之和/n个细胞 ②中国人正常SCE频率为5.7±0.4
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