细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

• 中文名

• 细胞培养

• 外文名

• cellculture

• 别名

• 细胞克隆

• 术语

• 细胞培养技术

• 地位

• 生物技术中最核心、最基础的技术

• 常用培养基

• 无钙、镁、离子溶液

1. 1基本概述

2. 2设施器材

3. 3培养基

4. 4具体步骤

5. 5一般过程

6. 6一般条件

1. ▪⑴温度

2. ▪⑵pH

3. ▪⑶渗透压

4. ▪⑷营养物

5. ▪⑸水

6. ▪⑹无菌条件

7. ▪⑺光

8. ▪⑻气体

1. 7培养条件

2. ▪动物细胞培养

3. ▪植物细胞培养

4. ▪微生物细胞培养

5. 8注意事项

6. 9意义

7. 10方式

1. ▪群体培养

2. ▪克隆培养

3. 11优点

4. 12不足

96孔细胞培养吸液

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。^[1]

设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。

器材：

一、玻璃器材

无菌室

培养皿、滴流瓶、刻度吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶

二、塑料器材

多孔培养板、培养皿、培养瓶

三、橡皮器材

橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。

四、金属器材

剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头

五、其他物品

纱布、注射器和针头

几种常用细胞培养基产品

⒈BME（basalmediumeagle）基础伊格培养基

⒉MEM

⒊DMEM

⒋IMDM

⒌RPMI-1640

⒍M199

⒎Mccoy's5A

⒏F10F12DMEM混合F12（三）几种常用细胞培养配套试剂的配置（缓冲液、平衡盐溶液等）

1、无钙、镁、离子溶液（1000ml)

氯化钠（NaCl)8g磷酸二氢钠、（NaH2PO4H20）0.05g、氯化钾（KCl)0.2g、碳酸氢钠（NaHCO3）1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20）1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL

2、PBS（Phosphate-Bufferedsaline）磷酸盐缓冲液

甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠（无水）28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠（无水）2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。

3、Hanks液（HBSSHank‘sBalancedsaltsolution)

⑴母液甲（20x）配法

①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。

②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。

待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。

⑵母液乙（20×）配法

①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖（A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。

②0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。

待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。

3）使用液（1×）配法

取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟（以免葡萄糖破坏），置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。

4、Eagle's液（EBSSEagle'sBalancedsaltsolution)

是一种在二氧化碳（CO2）环境中短期维持细胞活性的平衡盐溶液，可用于细胞解离前的清洗、细胞或组织的运输、细胞计数时稀释、溶液的配置等。

5、HEPES液

生物缓冲液，化学性质稳定，在PH7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。

6、NaHCO3缓冲液

常规缓冲体系的一部分，但是不稳定，易受空气中CO2的含量而改变PH值，影响缓冲效果。

一、复苏^[1]

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动（注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管）。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO₂培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：70%的完全培养基20