实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.刮取细胞时准备Dynabeads，洗涤缓冲液和5×第一链缓冲液混合液（置于冰上）。

2.充分悬起Dynabeadsoligo（dT）₂₅，转移100ul到一个无RNase的硅烷化微量离心管里，置于磁座上。30s后去除上清，不要扰动磁珠。

3.轻弹或轻轻涡旋把磁珠重悬于500ul裂解/结合缓冲液中。把磁珠留在缓冲液里直到准备把它加到细胞裂解液里。加到细胞裂解液里前移出磁珠。

4.在一个2ml的微量离心管里用1ml的裂解/结合缓冲液裂解100000～1000000个细胞（或2～10mg的组织），用组织匀浆器匀浆1min。如果有必要的话，最高速离心1min去除细胞残渣。使用匀浆器前，彻底清洗，再用100％的乙醇淋洗，用1L的DEPC处理的双蒸水洗涤。

5.立刻用一个1ml的注射器使裂解液通过一个23-G的针头撕裂基因组DNA。把洗过的磁珠和裂解液混合，室温用手连续晃动温育3～5min。

6.把管子放到磁座上2min，弃掉上清（上清可以保存用作DNA的实验）。

7.用一个P200带滤芯的吸头上下吹吸洗涤磁珠。按下面的顺序洗涤：

7.11ml含20ug/ml糖原的洗涤缓冲液A（1ml洗涤缓冲液中加入1ug20mg/ml的糖原），两次。

7.21ml含20ug/ml的糖原的洗涤缓冲液B，—次。

7.3200ul1×第一链缓冲液混合液（用DEPC水从试剂盒中的5×第一链缓冲液混合液稀释），4次。

8.把磁珠重悬于下面的第一链合成混合液里：

54ulDEPCddH₂O

18ul5×第一链缓冲液

9ul0.1mol/LDTT

4.5ul10mmol/LdNTP

把管子置于37°C2min，然后加入3ul200U/ulSuperScriptII逆转录酶。37°C温育1h，每10min用手混匀磁珠。把管子置于冰上中止反应。

9.在冰上往第一链的反应里加入如下第二链合成的成分，次序如下：

227ulddH₂O，预冷

150ul5×第二链缓冲液

15ul10mmol/LdNTP

3ul10U/ulE.coliDNA连接酶

12ul10U/ulE.coliDNA聚合酶I

3ul2U/ulE.coliRNaseH

16°C温育2h，每10min用手混匀磁珠。

10.温育后，把管子置于冰上加入100ml0.2mol/LEDTA中止反应。

11.用含0.1％SDS和2×乙酰化的BSA的1×BW缓冲液洗一次（如果不加BSA，珠子会变得很黏）。

12.用500ul含2×BSA的1XBW缓冲液洗3次。重悬在500ul含2×BSA的1×BW缓冲液中，70°C加热20min失活Poll的核酸酶活力。

13.用500ul含2×BSA的1×BW缓冲液洗3次。然后用200含2×BSA的1×NEB缓冲液4（随NlaⅢ提供）洗2次（第一次用NEB缓冲液/BSA洗完后转移到一个新管里）。取5ul最后的磁珠悬液，用已知存在于所要建库CDNA中的基因引物，PCR检查cDNA的完整性

14.把磁珠重悬于下面的混合液中：

171ulLoTE缓冲液

4ul100×BSA

420ul10×NEB缓冲液4

5ulNlaⅢ

37°C温育1h。

15.温育后，把管子置于磁座上约30S，然后用下面的溶液和P200带滤芯的吸头上下吹吸几次洗涤：

500ul含1％Tween20和2×BSA的1×BW缓冲液，2次

500ul含2×BSA的1×BW缓冲液，4次

200ul1×T4DNA连接酶缓冲液，2次

最后重悬于连接酶缓冲液后，每个样品转移100ul到2个新的硅烷化的微量离心管里。

16.移弃最后的洗涤液，珠子重悬在下面的溶液里：

5ulLoTE缓冲液（两管）

2ul5×T4DNA连接酶缓冲液（两管）

3ul2ng/ul连接子1A，B（已复性的；管1）

3ul2ng/ul连接子2A，B（已复性的；管2）

17.50°C加热管子2min后置于室温5～10min。每管中加入1ul5U/ul高浓度T4DNA连接酶，16°C温育2h。间歇混匀。

18.连接后，置于磁座上约30s，然后每个样品用500ul含0.1％SDS和2×乙酰化的BSA的1×BW缓冲液洗两次（第一次洗后合并管1和管2，以减少后续步骤的损失）。

19.用500ul含2×BSA的1×BW缓冲液洗4次；用200ul含2×BSA的1×NEB缓冲液4洗两次（第一次用NEB缓冲液/BSA洗后，转移到一个新的管里）。

20.65°C预热下面的混合液2，重悬起磁珠：

170ulLoTE缓冲液

4ul100×BSA

20ul10×NEB缓冲液4

2ulBsmIII

65℃温育1h，间歇混匀。

21.温育后，最高速离心2min，然后转移上清到一个新的1.5ml的微量离心管。用40ulLoTE缓冲液洗一次，最后终体积为240ml。

22.用240ulPC8抽提，用4ulSeeDNA乙醇沉淀：

22.1加入4ulSeeDNA［或4ul3：1（V/V）的糖原和SeeDNA混合物］

22.2加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠（24ul），混匀

22.3加入2倍体积的100％乙醇（480ul），混匀

22.4室温温育2min

22.5最高速离心5min

22.670％的乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心地移出并弃去残余液体，重悬于10ulLoTE缓冲液。

23.加入下面的混合液：

30.5ulddH₂O

5ul10×Klenow缓冲液（或Roche缓冲液H）

2.5ul10mmol/LdNTP

1ul100×BSA

1ulKlenow

37°C温育30min后，加入190ulLoTE缓冲液（240ul终体积）。

24.用等体积（240ul）的PC8抽提。转移200ul到一个连接酶「＋」的管里，余下的40ul到连接酶「-」的管里。

25.用2ulSeeDNA、0.1倍体积乙酸钠和2倍体积的100％乙醇沉淀。70％乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心移去残余液体，晾干5~10min。重悬于2ulLoTE缓冲液。

26.准备2×连接酶「＋」混合液：

2.5ul3mmol/LTris·Cl，pH7.5

3.0ul5×T4DNA连接酶缓冲液

2.0ul5U/ul的高浓度T4DNA连接酶

准备2×连接酶「-」混合液：4.5ul3mmol/LTris·Cl，pH7.5和3.0ul5×T4DNA连接酶缓冲液。加入2ul合适的混合液到＋/-连接酶样品里，在热循环仪上16°C过夜（8～12h）。

27.连接后，加入98ulLoTE缓冲液，优化PCR条件，然后进行大规模的PCR扩增。

28.准备大规模PCR的反应混合液（2～3个96孔板，每孔50ul反应液），每个反应的成分如下：

5ul10×SAGEPCR扩增缓冲液

3ulDMSO

4.0～10ul10mmol/LdNTP

1ul350ng/ulPCR引物1

1ul350ng/ulPCR引物2

用ddH₂O调整体积到49ul

0.7ul5U/ulPlatinumTaqDNA聚合酶

每孔分装入49ul反应混合液，然后加入1ul适当稀释的模板。

29.热循环仪运行如下程序：

1轮：

2min94°C

26～32轮：

30s94°C（变性）

1min55°C（复性）

1min70°C（延伸）

1轮：

5min70°C（终产物延伸）

连接酶「-」的样品应当扩增35轮。

不要对PlatinumTaqDNA聚合酶使用传统的热启动PCR。

30.把PCR反应物混合到一个50ml的锥形管里，用LoTE缓冲液扩大体积到11.5ml，然后用等体积的PC8抽提。

31.乙醇沉淀：

11.5ml样品

10ulSeeDNA

100ul糖原

5.1ml7.5mol/L乙酸铵

38.3ml100％乙醇

干冰/甲醇浴15min。然后室温溶化2min。

32.轻轻涡旋混匀，台式离心机的吊桶转子室温约3000g（4000r/min）离心30min。

33.用5ml70％的乙醇祸旋，洗漆，吊桶转子约3000g室温离心5min。

34.沉淀重悬于216ulLoTE缓冲液。加入54ul5×上样缓冲液（终体积270ul）。

35.3个20％聚丙烯酰胺/TBE凝胶，每孔上样10ul。在27个泳道用加长的吸头上样，每个加10ul（不要过载）。每块凝胶加10ul20bp序列阶梯作分子质量参照物。

36.160V电泳90min到距凝胶底约1cm，使103bp的双标签片段和80bp的连接子-连接子二者尽可能分开。

37.在一个用锡箔包好的容器里染凝胶，50mlTBE缓冲液中加入2～5ulSYBRGreenI。让凝胶在水平摇床上浸泡15min，在用SYBRGreenI或UV滤镜的UV盒上观察。

38.从凝胶上只割出扩增的带双标签的产物，把3个割出的凝胶放在硅烷化的0.5ml离心管里（总共9个0.5ml的管子），这些管子的底部都有一个直径约0.5mm的小孔（用21-G针头刺的）。

39.把0.5ml的离心管放在2.0ml的硅烷化的离心管里，最高速离心4min（这样可以使聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在2.0ml的管底）。

40.扔掉0.5ml的离心管。每个2.0ml离心管中加入250ulLoTE缓冲液和50ul7.5mol/L的乙酸铵。

41.涡旋每个管子，然后置65°C15min。在18个Spin-X离心管的滤膜上各加5ulLoTE缓冲液。

42.把每个管里的溶液转移到2个Spin-X的离心管滤膜上（即9管转移到18个Spin-X的离心管滤膜上）。最高速离心5min。合并两份洗脱液（总共300ul），转移到1.5ml的微量离心管里。有时，纯化的102bp的条带不能被NlaIII重新切开，这可能和纯化得不干净有关。如果出现这种问题，把300ul洗脱液通过Qiaquick凝胶抽提方案抽提一次，终体积调回到300ul。

43.洗脱液进行乙醇沉淀：

300ul样品

0.5ulSeeDNA

1.5ul糖原

133ul7.5mol/L乙酸铵

1000ul100％乙醇

涡旋，置于干冰/甲醇浴15min。室温2min使融化，然后4°C离心15min。

44.最高速离心15min。75％的乙醇洗两次。每管DNA重悬于10ulLoTE缓冲液。混合样品到一个管里（总量90ul）。

45.用NlaIII消化DNA：

90ulLoTE缓冲液中的PCR产物

226ulLoTE缓冲液

440ul10×NEB缓冲液4

4ul100×BSA

40ul10U/ulNlaIII

37°C温育1h。

46.用等体积的PC8抽提。混合水相转移到1.5ml微量离心管。在干冰上乙醇沉淀：

200ul样品

66ul7.5mol/L乙酸铵

3ulSeeDNA

825ul100％乙醇

涡旋混匀，置于干冰/甲醇浴15min。

47.室温2min使融化，然后4°C离心15min。

48.冷的75％乙醇洗一次，用细头的吸头吸掉残余的乙醇。重悬沉淀于40ulLoTE缓冲液。在冰上加入5×上样缓冲液（总共50ul）。

49.把样品加到一个20％聚丙烯酰胺凝胶的4个泳道中，隔开一个泳道加上20bp序列阶梯作为分子质量参照物，160V电泳2.5h。用1：10000的SYBRGreenI染15min。

50.在长波UV照射下切出24～26bp的条带，每两个条带放到一个底部有约0.5mm小洞的0.5ml的微量离心管中（用21-G针头刺的）。

51.把管子放在2.0ml的硅烷化的离心管里，最高速离心2min。

52.扔掉0.5ml的离心管。每个2.0ml离心管中加入250ulLoTE缓冲液和50ul7.5mol/L的乙酸铵。涡旋每个管子，然后置于37°C15min。不要在65°C温育。这会使得26bp片段变性。可以温育更长一点的时间（甚至过夜），但看起来并不会显著提高产量。

53.用Spin-X离心管滤膜按步骤42方法分离洗脱液。分在3个管里（每个200ul）进行乙醇沉淀：

200ul样品

66ul7.5mol/L乙酸钱

2ulSeeDNA

3ul糖原

825ul100％乙醇

置于干冰/甲醇浴10min，然后4°C离心15min。

54.用冷的75％乙醇洗两次。每个DNA样品重悬于2.5ul冷的LoTE缓冲液（总共7.5ul）。在加入连接缓冲液前使纯化的双标签片段保持在冰上很重要。高AT含量的小片段即使在LoTE缓冲液中，室温下也会变性。

55.混合下面的试剂：

7ul混合的双标签DNA

2ul5×连接缓冲液

1ul5U/ul高浓度T4DNA连接酶

16°C温育1～3h。

不要连接过夜，因为这样会使得串联产物很长而难于克隆。

56.连接完成后，加入2.5ul5×上样缓冲液。65°C加热样品5min，立刻置于冰上。

57.在10％～12％的聚丙烯酰胺/TBE凝胶上分离串联体。在第一个泳道里加上1kb的分子质量参照物，隔一个泳道把串联的样品全部加到第3个孔里。200V电泳45min。

58.用1：10000的SYBRGreenI染15min。在UV盒上观察，分出感兴趣的区带。

59.把每一块凝胶放入底部有约0.5mm小洞的0.5ml微量离心管中（用21-G针头刺的）。

60.把0.5离心管连同凝胶块放入2.0ml的硅烷化的离心管里，最高速离心2min，把聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在2.0ml的管底。

61.扔掉0.5ml的离心管。2.0ml离心管中加入300ulLoTE缓冲液。涡旋每个管子，然后置于37°C15min。

62.把每个管里的东西转移到2个Spin-X的离心管滤膜上（总共4个Spin-X管子），最高速离心5min。

63.每两个Spin-X管子的洗脱液合并在一个1.5ml离心管中，加入乙醇进行沉淀：

300ul洗脱液

2ulSeeDNA

133ul7.5mol/L乙酸铵

1000ul100%的乙醇

64.最高速离心15min。70%乙醇洗两次，晾干5min。纯化的串联DNA重悬于6ulLoTE缓冲液。

65.在10ul的体系里，用SphI消化1ugpZErO-1质粒：

1ulpZErO-1质粒

7ulddH₂O

1ul10×NEB缓冲液2

1ulSphI

37°C温育15～30min,然后　65°C加热10min灭活。不要消化超过30min。

66.琼脂糖凝胶电泳检查消化是否完全。用90ulpH8.0的TE稀释切好的载体，然后用等体积PC8抽提。乙醇沉淀，75%乙醇洗涤2次，重悬于40ul水或TE缓冲液中（约25ng/ul载体）。

67.混合下面的连接反应液，同时配制一份不加串联体的对照反应：

6ul纯化的串联体（对照中不加）

1.5uldH₂O（对照中7.5ul）

1ul25ng/ulSphiI切好的pZErO质粒

1ul10×T4DNA连接酶缓冲液

0.5ul4U/V的T4DNA连接酶

16°C温育2h。

pZErO质粒的厂商提醒如果温育时间长于1h会使背景增高，原因可能是ccdB死亡基因上自然发生的突变。

68.用LoTE缓冲液把样品调整到200ul用等体积的PC8抽提，然后乙醇沉淀：

200ul样品

133ul7.5mol/L乙酸铵

2ulSeeDNA

777ul100%的乙醇

69.70%乙醇洗4次。最高速快速离心，弃去70%乙醇，晾干5min。重悬于10ulLoTE缓冲液。

70.把所需数量的0.1mm的微电击杯和1.5ml的离心管置于冰上。

71.在合适数量的15ml培养管里加入1mlSOC培养基，置于室温。

72.往冰上的1.5ml离心管中加入1ul步骤69中的DNA。在一个标有「对照」的管里加入1ul0.01ng/ul的pUC19对照DNA，用作转化效率的测定。余下的DNA保存在-20°C。

73.从-70°C移出DH10B电转感受态细胞，置于冰水上，当细胞融化后，轻弹管子混匀细胞。

74.每个冷的含DNA1.5ml的离心管里加入40ul感受态细胞。未使用的细胞用干冰/甲醇重新冻起来，然后放回-70°C。

75.把40ul细胞/DNA混合物加入到一个预冷的一次性微电击杯中。用Bio-Rad基因脉冲电转仪在100Ω/25uF/1.8kV的条件下进行电转。

76.把电转过的细胞转移到一个15ml的培养管里，马上加入1ml室温的SOC培养基。37°C，225r/min摇动15min。

作者发现涂板前先培养15min,能使转化效率达到1.0×10¹⁰cfu/ugpUC19。

77.1:100稀释用pUC19电转的对照细胞，取100ul涂在含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。

78.每个10cm的含zeocin的低盐LB平板上涂1/10转化的细菌。培养12～16h后分析。如果插入片段大小合适的话，每个串联反应的10个平板都要保存，以备以后测序。

79.用50ul的PCR反应检查插入片段的大小。配制反应混合液（下面的体积乘以总样品个数加上1或2以防吸量损失）：

2.5ul10×SAGEPCR扩增缓冲液

1.25ulDMSO

1.25ul10mmol/LdNTP

0.5ul350ng/ulM13正向引物

0.5ul350ng/ulM13反向引物

43ulddH₂O

0.75ul10:1U的Taq:PfuDNA聚合酶

96孔板的每孔中加入50ul混合液。

80.用无菌的牙签或吸头轻轻挑起克隆然后把头放入PCR混合液里搅动几下。

81.用热循环仪执行下面的扩增程序：

1轮：

2min95°C

25轮：

30s94°C（变性）

1min55°C（复性）

2min72°C（延伸）

1轮：

5min70°C（终产物延伸）

基于TaqDNA聚合酶的PCR扩增，0.5～1min/kb的模板扩增延伸时间就足够了，与此相反，基于Pfu的PCR扩增，至少1～2min/kb才能达到类似的合成效率。

82.取4ul在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电压约150V。

大规模筛选时，使用多通道移液器和OwlCentipede50孔的水平电泳系统。多通道移液器的吸头和OwlCentipede配备的50齿的梳子正好合适（每隔1孔）。因此为保持每个96孔板的连续的点样顺序，需要另外准备一块装有上样染料的96孔板。

83.用作测序的2ulPCR产物（所需的确切用量取决于测序的方案，并应当优化）用下述方法处理：

0.1ul外切核酸酶I

0.1ul虾碱性磷酸酶

1.8ul50mmol/LTris·Cl，pH8.0

加2ul消化混合液到2ulDNA中。

84.在热循环仪上进行反应，37°C温育15min,然后80°C加热15min。加水到15ul。直接取2ul稀释的PCR产物测序。

85.从SAGEnet下载SAGE的分析软件（见因特网资源），按说明分析。