人MTHFR和MTRR基因检测试剂盒相关交流-蚂蚁淘在线

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规格：	盒

人MTHFR和MTRR基因检测试剂盒(荧光PCR法)说明书
【产品名称】
通用名称：人MTHFR和MTRR基因检测试剂盒(荧光PCR法)
英文名称：HumanMTHFRandMTRRGeneDetectionKit
【包装规格】48人份/盒
【预期用途】本试剂盒用于定性检测人全血样本中亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T位点、A1298C位点和甲硫氨酸合成酶（MTRR）基因A66G位点的基因多态性，进行基因分型。
本产品检测结果仅代表对人MTHFR和MTRR基因的检测结果，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。
【检验原理】本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）结合TaqMan-MGB探针技术，针对人类MTHFR和MTRR基因3个多态性位点，设计3套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同通道检测一个位点的基因多态性。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成分】

序号	名称	主要组成成分	规格（48人份/盒）
1	检测液A	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、A1298C引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
2	检测液B	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、C677T引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
3	检测液C	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、A66G引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
4	阳性对照	A1298C-AA和A1298C-CC、C677T-CC和C667T-TT、A66G-AA和A66G-GG、MTIC-质粒混合液	1×100μL
5	阴性对照	TEbuffer	1×100μL

说明：不同批号的组分不可以互换使用。
【储存条件及有效期】试剂盒于-20℃±5℃避光贮存，避免反复冻融，在正确储存条件下有效期为12个月。采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封进行运输，运输时间不宜超过7天；PCR反应液及检测液反复冻融不宜超过10次，试剂开封后请于2个月内使用。
生产日期和使用期限见产品标签。
【适用仪器】ABI7500荧光定量PCR仪。
【样本要求】本试剂盒适用于从2mLEDTA抗凝全血中提取人类基因组DNA进行检测。
样本采集后应及时进行处理及检测，可在2℃～8℃可保存7天，长期保存应置于≤-20℃条件下，避免反复冻融。
样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。
【检验方法】

PCR前处理
1. 试剂配制（试剂准备区）

从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，涡旋混匀，瞬时低速离心。

2）核算当次实验所需要的反应数（N），按照20μl/孔的分装量将3种反应液分装到N个PCR反应管内（反应孔布局请参见表2）。PCR反应管通过传递窗转移至样本处理室，剩余试剂放回-20℃±5℃冰箱避光保存。
N=（样本数+阴性对照（1T）+阳性对照（1T））×3。

1. 样本提取（样本准备区）

参考所购买的商用基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
推荐使用天根生化科技（北京）有限公司血液基因组提取试剂盒（TIANampBloodDNAKit，DP318），用于血液基因组DNA的提取。

1. 加样（样本准备区）

将待测样本的基因组DNA、阴性对照、阳性对照分别加入已装有3种反应液的PCR反应管，加入量为5μl/孔。盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。瞬时低速离心，将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后不能立即上机，建议将加好模板的PCR反应管置于2~8℃暂时保存，并在24小时内尽快上机检测。
表2：96孔PCR板排布示意图

	1	2	3	…	12
A	预混液A 阳性对照	预混液B 阳性对照	预混液C 阳性对照	…	预混液C 样本23
B	预混液A 阴性对照	预混液B 阴性对照	预混液C 阴性对照	…
C	预混液A 样本1	预混液B 样本1	预混液C 样本1	…
……	……	……	……	…
H	预混液A 样本6	预混液B 样本6	预混液C 样本6	…	预混液C 样本30

PCR扩增

将准备好的PCR反应板或反应管放置在仪器样本槽相应位置，并记录放置顺序。按表3设置仪器扩增相关参数：
表3：仪器扩增相关参数

步骤		温度	时间	循环数
1	预变性	95℃	5min	1cycle
2	变性	95℃	10s	40cycles
3	退火、延伸及检测荧光	60℃	45s	40cycles
步骤3收集荧光信号，检测通道：FAM、VIC、ROX

*注：passivereference和quencher处均选择“none”。

基线和阈值设定

反应结束后，根据扩增曲线，设定合适的基线（Baseline）和荧光阈值（Threshold）。Baseline设为3-15（根据实际情况，BaselineCycler可在一定范围内变化），荧光阈值一般设定在扩增曲线指数增长期的拐点，得到不同通道的Ct值。

质量控制

阴性对照检测结果应为：三个反应体系中FAM、VIC、ROX均无扩增曲线，且Ct显示为Undet；
阳性对照检测结果应为：三个反应体系中FAM、VIC、ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤33。

试验结果的判定

在三个反应体系中对照均正常的情况下，结果判断如下：
表4：结果判定

反应液	基因型	FAM通道	VIC通道	ROX通道
检测液A(A1298C)	AA 纯合野生	Ct<38	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38
	AC 杂合突变	Ct<38	Ct<38	Ct<38
	CC 纯合突变	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38	Ct<38
检测液B(C677T)	CC 纯合野生	Ct<38	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38
	CT 杂合突变	Ct<38	Ct<38	Ct<38
	TT 纯合突变	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38	Ct<38
检测液C(A66G)	AA 纯合野生	Ct<38	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38
	AG 杂合突变	Ct<38	Ct<38	Ct<38
	GG 纯合突变	Ct≥38 或无Ct值	Ct<38	Ct<38

待检样本内标ROX通道Ct值如果≥38，则需对核酸提取物进行重复检测，如仍≥38，则需重新对样本进行提取或者重新采样提取后进行检测。
【参考值区间】根据临床样本检测结果的数据统计确定参考值范围，并通过大量样本的检测结果对该参考值进行确认。结果根据表4进行判定。
【检验结果的解释】
本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及及治疗反应等情况综合考虑。试验过程中可能受到以下因素的影响：

不合理的样本采集、转运及处理导致的检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限，会导致结果判读的错误；
实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染也会导致结果判读错误；
试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，会出现与实际不符的结果。

当试验检测结果出现以下情况时，需要重复进行测试并对结果进行确认：

阴性对照扩增结果出现扩增曲线，说明检测过程中某个环节或环境中出现污染；
阳性对照无扩增曲线，或某通道Ct值>33，说明操作出现失误或试剂性能下降明显；

【检验方法的局限性】

本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
模板DNA的质量可能受样本来源、采集过程、运输条件、样本处理等因素影响，同时也受DNA提取方法、PCR仪类型、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等的限制，可能导致出现假阳性和假阴性的检测结果。
有关假阴性结果的可能性分析：

不合理的样本采集、转运及处理、样本浓度过低均有可能导致假阴性结果。
待测靶序列的变异或其它原因导致的序列改变可能会导致假阴性结果。

低于产品最低检测限的样本无法检出。

【产品性能指标】
1.本试剂盒最低检出限：1×10²copies/μL。
2.分析特异性：每管检测液检测MTHFR基因上检测位点以外其它两个区段以及和MTRR基因检测位点以外其它两个区段的基因序列合成的阳性质粒，以及金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的基因组DNA均不会发生交叉。
3.准确度：企业阳性参考品检测结果均为阳性，阳性符合率100%。
4.精密度：用精密度参考品（1×10⁵copies/μL）进行检测（n=10），检测结果Ct值的变异系数（CV,%）均＜5.0%。
【注意事项】
1.试剂盒使用前应仔细阅读说明书。
2.本试剂盒不含人源性组分。
3.本试剂盒为体外检测试剂。操作人员应经过专业培训并具有一定经验。
4.实验严格分区操作，各区物品、工作服均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后请立即清洁工作台。
5.本产品使用前应在室温充分融化，混匀并瞬时低速离心。
6.每次实验应设置阴性质控和阳性质控。不同批号的试剂请勿混用，于有效期内使用试剂盒。
7.冻存的DNA样本，加样前应在室温充分融化、混匀并瞬时低速离心后使用。
8.荧光PCR仪为精密性仪器，应定期维护及校正，以确保实验数据的准确性。
9.本试剂盒所涉及的待测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合卫生部《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。
【参考文献】
[1]李金明.实时荧光PCR技术人MTHFR和MTRR基因检测试剂盒(荧光PCR法)说明书
【产品名称】
通用名称：人MTHFR和MTRR基因检测试剂盒(荧光PCR法)
英文名称：HumanMTHFRandMTRRGeneDetectionKit
【包装规格】48人份/盒
【预期用途】本试剂盒用于定性检测人全血样本中亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T位点、A1298C位点和甲硫氨酸合成酶（MTRR）基因A66G位点的基因多态性，进行基因分型。
本产品检测结果仅代表对人MTHFR和MTRR基因的检测结果，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。
【检验原理】本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）结合TaqMan-MGB探针技术，针对人类MTHFR和MTRR基因3个多态性位点，设计3套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同通道检测一个位点的基因多态性。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成分】

序号	名称	主要组成成分	规格（48人份/盒）
1	检测液A	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、A1298C引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
2	检测液B	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、C677T引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
3	检测液C	PCR缓冲液、dNTPs、Taq、A66G引物和探针、内标引物和探针	1×960μL
4	阳性对照	A1298C-AA和A1298C-CC、C677T-CC和C667T-TT、A66G-AA和A66G-GG、MTIC-质粒混合液	1×100μL
5	阴性对照	TEbuffer	1×100μL

PCR前处理
1. 试剂配制（试剂准备区）

从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，涡旋混匀，瞬时低速离心。

1. 样本提取（样本准备区）

1. 加样（样本准备区）

	1	2	3	…	12
A	预混液A 阳性对照	预混液B 阳性对照	预混液C 阳性对照	…	预混液C 样本23
B	预混液A 阴性对照	预混液B 阴性对照	预混液C 阴性对照	…
C	预混液A 样本1	预混液B 样本1	预混液C 样本1	…
……	……	……	……	…
H	预混液A 样本6	预混液B 样本6	预混液C 样本6	…	预混液C 样本30

PCR扩增

将准备好的PCR反应板或反应管放置在仪器样本槽相应位置，并记录放置顺序。按表3设置仪器扩增相关参数：
表3：仪器扩增相关参数

步骤		温度	时间	循环数
1	预变性	95℃	5min	1cycle
2	变性	95℃	10s	40cycles
3	退火、延伸及检测荧光	60℃	45s	40cycles
步骤3收集荧光信号，检测通道：FAM、VIC、ROX

*注：passivereference和quencher处均选择“none”。

基线和阈值设定

质量控制

阴性对照检测结果应为：三个反应体系中FAM、VIC、ROX均无扩增曲线，且Ct<

温馨提示：不可用于临床治疗。

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