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以前生化方面的实验接触很少，最近做一个酶抑制剂筛选工作，酶活性通过生成物吸光度测定。查了一些文献，发现酶的用量和底物用量文献之间差别很大，我想问一下
1.对于抑制剂筛选工作（求ic50）是不是体系内酶与底物的量（底物应该是过量的）对实验结果影响不大。
2.如果要求算Km值，是不是需要知道反应产物的绝对量。反应时间文献上都是5分钟，反应速度就用反应产物量除以反应时间即可。
3.酶是进口分装的，规格5U，一次用不完，用PBS稀释后如何保存
谢谢
1.对于抑制剂筛选工作（求ic50）是不是体系内酶与底物的量（底物应该是过量的）对实验结果影响不大。
2.如果要求算Km值，是不是需要知道反应产物的绝对量。反应时间文献上都是5分钟，反应速度就用反应产物量除以反应时间即可。
3.酶是进口分装的，规格5U，一次用不完，用PBS稀释后如何保存
谢谢
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回复：时间：2009-02-23
1.对于抑制剂筛选工作（求ic50）是不是体系内酶与底物的量（底物应该是过量的）对实验结果影响不大。酶和底物的用量会影响IC50的值，但不会很大，所以可以归为“对实验结果影响不大”。2.如果要求算Km值，是不是需要知道反应产物的绝对量。反应时间文献上都是5分钟，反应速度就用反应产物量除以反应时间即可。有能力和条件的话，做一个kinetic试验吧，即在不同底物浓度条件下生成产物的量随时间变化的曲线，然后通过求取曲线线性范围内的斜率来得到不同底物浓度条件下的反应速率V，再以V对[s]作图，通过MM方程来curve fitting，得到Km。如果做不了kinetic的话，那么在反应的线性范围时间内，做end point法，然后“反应速度就用反应产物量除以反应时间即可”。3.酶是进口分装的，规格5U，一次用不完，用PBS稀释后如何保存加20-50％的甘油，不同protocol提供的方法不一样，冻存于-80冰箱。有必要的话添加NaN3，但由于有毒，一般就不加了。
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