1.4μm石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3×3min。

2.首先用0.3％过氧化氢甲醇破坏内源性过氧化物酶的活性，室温20min。

3.PBS洗3×3min。

4.抗原修复，室温冷却20min。

5.PBS洗3×3min。

6.第二次用0～3％过氧化氢PBS破坏内源性过氧化物酶的活性，室温5min。

7.用温的（35℃）TBST[0.02mol/L（pH7.8）Tris-HCl+NaCl+0.1％Tween20]洗3×3min。

8.滴加蛋白阻断剂（0.25％酪蛋白），以阻断第一抗体的非特异性结合位点，10min，不洗。

9.滴加适当稀释的第一抗体（在S-P法基础上5～10倍稀释），37℃孵育15～60min，或4℃过夜。

10.PBS洗3×3min，温的（35℃）TBST洗3×3min。

11.滴加蛋白阻断剂（0.25％酪蛋白），以阻断多聚物试剂的非特异性结合位点，10min，不洗。

12.多聚物（EnVision）孵育15min，温热（35℃）TBST洗3×3min。

13.滴加蛋白阻断剂（0.25％酪蛋白），以阻断CSA试剂的非特异性结合位点，10min，不洗；如用荧光素标记酪胺需用TBST洗3次。

14.用生物素标记酪胺孵育15min；如用荧光素标记酪胺孵育15～30min。温热（35℃）TBST洗3×3min。

15.链霉亲和素-HRP37℃孵育15min或HRP标记的抗FITC抗体孵育30min，温的（35℃）TBST洗3×3min。

16.0.04％DAB（含0.03％H₂O₂）显色5～10min。

17.复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。