细胞系追踪实验已证明Six2可作为NPC的特异性标志[2-3]。起初研究人员主要关注从13.5天胎龄小鼠中分离得到的Six2-GFP阳性细胞，因这些细胞紧密聚集，研究人员推测细胞间通讯对NPC的存活与增殖具有重要作用，因此研究人员开始使用3D培养方法培养Six2-GFP阳性细胞。通过对前人研究的综合，研究人员认为BMP7,FGF9(或FGF2),heparin和Y27631 (BFHY)的组合对于Six2的表达具有重要作用，然而实际结果并非如此，Six2-GFP阳性细胞在培养7天后Six2的表达就开始大幅下调。因此研究人员在BFHY的基础上继续寻找突破口，令人欣慰的是，当在BFHY的基础上同时加入CHIR99021及LIF后，Six2-GFP阳性细胞便实现了长期稳定扩增，研究人员将该培养基命名为NPCself-renewal培养基（NPSR）。到目前为止，Six2-GFP阳性细胞在NPSR/3D条件下能够连续培养17个月，连续传代110次。而这些长期扩增的Six2-GFP阳性细胞同时表达了其他类型的NPC特异性标志（SIX2+,约96.2%;SALL1+,约99.1%；CITED1+,约96.1%）。

长期扩增的鼠源NPC依然具有肾形成潜能

研究人员将传代60次的NPC与胚胎脊髓体外共培养，发现最早可于第3天观察到管状结构的出现。肾小球特异性标志（PODXL，SYNPO，WT1），近端小管特异性标志（LTL，AQP1），髓袢特异性标志（CDH1）及远端小管特异性标志（PAX2，DBA）均呈阳性，且这些细胞的空间分布与肾组织极为相似，因此长期扩增的鼠源NPC具有在体外形成肾的能力。

经鼠源NPC高效形成肾元类器官

为消除分化对胚胎脊髓的依赖，研究人员试图创造一种化学成分确定的培养基来诱导肾元类器官的形成。研究表明Wnt信号通路的激活能够触发NPC的分化[4]，因此研究人员使用GSK3抑制剂CHIR99021（CH）及FGF2（F2），结果表明经CH/F2处理的NPC进一步分化为细胞命运限定的NPC（FS-NPC），而FS-NPC能自发分化为肾元类器官。

 

鼠源NPC在体分化潜能

研究人员将FS-NPC移植进入新生鼠的肾皮质中，7天后mCherry标记的FS-NPC在肾皮质中形成了管状结构，免疫荧光技术证明FS-NPC与宿主细胞形成了嵌合的远端小管，近端小管及血管化的肾小球。在部分小鼠中，研究人员甚至观察到了完整的LTL+的近端小管及BRN1+/DBA-的髓袢结构。

由鼠源NPC产生的旁分泌因子能改善肾功能

研究人员将FS-NPC的条件培养基（CM）注射入接受顺铂治疗的NSG小鼠（急性肾损伤模型）体内，对照组为非条件培养基。结果显示，条件培养基显著降低了血尿素氮（BUN）及血清肌酸酐水平（S-Cre）。

人源NPC的来源及长期扩增

NPSR/3D能否用于人源NPC的长期扩增是研究人员更为关心的问题。为了更精确地得到SIX2+细胞，研究人员详细分析了肾相关细胞的细胞膜特征蛋白，发现EpCAM排他性地表征了SIX2-细胞，NGFR特异性地表征了SIX2+细胞，因此EpCAM-/NGFR+标准可用于从人胚胎肾组织中分选SIX2+细胞（人源NPC）。人源NPC能够在NPSR/3D长期维持SIX2的表达，然而其生长速度缓慢。为解决这一问题，作者发现加入Smad1/5/8和Smad2/3信号通路的抑制剂能够有效促进人源NPC的增殖，因此人源NPC能够在改良型的NPSR/3D中长期扩增，同时保留了形成肾元类器官的潜能。