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链霉亲和素磁珠
使用方法
2.1、磁珠的准备
使用前,需要洗去磁珠上面的防腐剂。具体步骤如下:
(1)使用前将磁珠充分混匀,根据需要,吸取适当量磁珠悬浮液到EP管中,将EP管放在磁力架上,磁分离1-2 min,吸弃上清。
(2)取下EP管,加入与磁珠悬浮液等体积的清洗液,点震或漩涡振荡使磁珠充分悬浮于清洗液中,将EP管置于磁力架上,磁分离1-2 min,吸弃上清。
(3)重复(2)一次。
注:①如果下游是用于核酸类的操作清洗液用(1×B&W 缓冲液);②如果下游是用于蛋白类的操作清洗液用(PBS,pH=7.4)。后续的各种操作均需要清洗磁珠表面的防腐剂,清洗完毕后根据实验所需选择下列不同的程序。
2.2、固定程序
2.2.1 核酸
(1)对RNA 操作的准备
因为本产品没有对RNA 酶进行处理,如果后续试验进行RNA的操作,用与磁珠悬浮液等体积溶液A 洗磁珠两次,1-3 分钟;然后用与磁珠悬浮液等体积的溶液B 洗磁珠一次。
(2)用2×B&W 缓冲液悬浮经过上述磁珠,使终浓度为5 μg/μl,或实验应用的适宜浓度。
(3)加入与磁珠悬浮液等体积的生物素化DNA/RNA 水溶液。DNA/RNA的具体用量根据实验所需确定。
(4)室温下放置,轻轻旋转或时而轻敲离心管混合。孵育时间依赖结合的核酸长度:短的寡核苷酸(小于30 个碱基)需要的孵育时间不超过10 min。30 碱基至1kb 的孵育时间为15 min。
(5)磁珠此时被覆了生物素化的DNA/RNA 片段,用磁力架分离磁珠。将离心管放在磁力架上1到2 min。
(6)用1×B&W 缓冲液洗2-3 次,用磁力架吸附磁珠以利于洗涤。
(7)悬浮磁珠,稀释至所需浓度。此时磁珠已结合了经固定化后的DNA/RNA 片段,应用低盐浓度缓冲液悬浮磁珠,以利于下面的操作。
注:如果是对DNA的操作则省去2.2.1中步骤(1)。
2.2.2 抗体
(1)计算磁珠和生物素化抗体所需用量。每mg 链霉亲和素磁珠需要大约5-10μg 抗体。假定抗体100% 生物素化,此时链霉亲和素饱和。
(2)在EP管中加入一定量的PBS缓冲液、磁珠以及生物素化抗体,在室温下孵育(使磁珠在溶液中保持悬浮状态,但不能剧烈振荡)30 min,将EP管置于磁力架上,磁分离1-2 min,吸弃上清。
(3)用PBS/BSA 洗涤磁珠4-5 次,用磁力架辅助。
(4)悬浮磁珠稀释至所需浓度。
2.2.3 生物素化小分子
链霉亲和磁珠还可用于固定诸如小分子、肽类等生物素化配体。生物素化配体与磁珠结合能力依赖于磁珠与配体之间、及配体与配体之间的空间构型、及电荷相互作用。磁珠表面每个链霉亲和素有3-4 个结合位点。每mg 磁珠大约加入1000 pmoles 的生物素化小分子即可达到饱和,充分混合15-30 min。分子的大小决定实验中其需加入的浓度。在结合过程中,磁珠的浓度应在10-50 mg/ml。应用磁力架洗涤已被覆抗体的磁珠3-4 次,去除未结合物质。结合缓冲液的盐浓度和pH 值依据固化分子类型不同而不同。固化后的分子根据下游实验不同而选择合适的缓冲液。磁珠与固化分子的复合物在共用缓冲液中性能稳定。
2.3、生物素化分子的释放
生物素和链霉亲和素之间化学键的断裂需要严格条件。例如,将复合物置入pH=8.2、含95%甲酰氨的10 mM EDTA 中65 °C 孵育5 min 或90 °C 孵育2 min,超过96% 生物素化DNA 片段均可被特异地分离。另一种方法,可将与磁珠相连的固化靶分子置于0.1% SDS 中煮沸5 min。
2.4、溶液的配制
(1)2倍B&W 缓冲液:10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、2.0 M NaCl。
(2)溶液A:DEPC 处理的0.1 M NaOH;DEPC 处理的0.05 M NaCl
溶液B:DEPC 处理的0.1 M NaCl。
溶液A 与溶液B 的DEPC 处理过程:
向溶液A 和溶液B 中分别加入DEPC,使DEPC的终浓度达0.1%,用力震荡。室温放置1 小时,高压灭菌。
(3)PBS缓冲溶液:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 2mmol/L调节pH=7.4。
(4)PBS/BSA缓冲溶液:PBS/BSA (PBS, pH 7.4 含有0.1% (w/v) BSA)。
2.5、贮存与稳定性
密闭2-8 °C保存,在有效期内磁珠稳定,有效期标注在标签上。磁珠小瓶要竖直存放,以保证磁珠呈悬浮液,磁珠烘干会导致其性能下降。此产品不能冷冻。用前要充分悬浮磁珠链霉亲和素磁珠悬浮液未经核糖核酸酶灭活。要防止细菌污染磁珠。
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