1荧光素与抗体结合（标记）2荧光抗体的纯化3荧光抗体的鉴定1.荧光素与抗体结合方法：⑴透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记②标记较均匀，非特异荧光较低⑵搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品体积较大的抗体溶液的标记②标记时间短、效率较高，荧光素用量节省③影响因素多，非特异荧光较强**透析法第一步：将含10mg/ml的Ig溶液10ml装入透析袋。第二步：将上述透析袋放入烧杯中：含0.1mg/mlFITC的pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。第三步：4℃磁力搅拌24h。第四步：取出透析袋，进行纯化、鉴定**搅拌法第一步：将含40mg/mlBP溶液5ml装入反应瓶中。第二步：加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐缓冲液4ml第三步：25℃磁力搅拌下，逐滴加入1ml含2mg的FITC溶液第四步：25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌4h，然后进行纯化、鉴定2.荧光抗体的纯化：⑴除去未结合荧光素⑵除去标记不适当的抗体⑶除去非特异反应物质*****(1)除去未结合荧光素：A透析法：将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。B凝胶过滤法：葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.(2)除去标记不适当的抗体：采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。(3)除去非特异反应物质：将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合，4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。3.荧光抗体的鉴定：⑴抗体含量测定：双扩法⑵结合比率(F/P)测定：分光光度法，并按下式计算：FITC:F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)RB和TRITC:F/P=A515/A280*F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。*固定标本染色以F/P=1.5左右为宜*活细胞染色以F/P=2.4左右为宜

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