2021-07-20SMART PCR cDNA 合成试剂盒 说明书

问：SMARTTM cDNA 技术的原理是什么？答： SMARTTM cDNA 合成技术利用总RNA 或者Poly A+ RNA 作为模板，以一种改造的oligo(dT)寡苷酸作为引物，在MMLV 反转录酶催化作用下合成第一链。当反转录酶到达mRNA 的5'末端时，反转录酶的末端转移酶活性会在第一链 cDNA 的3'端加上3-5 个脱氧胞苷酸。SMART寡苷酸的3'端含有一段延长的鸟苷酸残基，与富集的胞苷酸退火形成延伸的模板。然后反转录酶转换模板，以SMART 寡苷酸作为模板继续延伸。这样合成得到的单链cDNA 在3'端有一段与SMART 寡苷酸互补的序列，在5'端有一段与oligo(dT)引物互补的序列。这些序列作为下一步进行长距离PCR 的引物合成位点。结果可以得到富集全长序列的双链cDNA。问：SMART试剂盒系列产品之间有什么差别？答： SMART cDNA Library Construction Kit 是用来从少量RNA 样本中构建高质量的cDNA 文库。试剂盒中包括有SMART cDNA 合成和文库构建到? TriplEx2 或者Creator 供体载体pDNR-LIB所需的试剂。因为该试剂盒是特别针对文库构建来设计的，所以它与Clontech™ PCR-Select™cDNA 差减杂交试剂盒不能配合使用。SMART PCR cDNA Synthesis Kit 可以用来与Clontech™ PCR-Select™ cDNA 差减技术一起使用。总RNA 不能直接用来做差减实验，但可以通过SMART PCR cDNA Synthesis Kit 来扩增出高质量的cDNA，从而可以用作杂交实验。同样，少量的Poly A+ RNA 也可以用SMART PCR cDNA Synthesis Kit 来扩增。SMART cDNA 也可以在你仅有有限的RNA 样本时从来做虚拟的Northern 杂交，用来代替标准的Northern 杂交。SMART PCR cDNA Synthesis Kit 含有SMARTⅡ寡苷酸和cDNA 合成引物，两段序列都具有用来做Clontech™ PCR-Select 差减所需的RsaⅠ位点。该试剂盒也可以从来构建SMART cDNA 文库于其它自选载体中。SMART RACE cDNA Amplification Kit 结合了SMART cDNA 合成技术和RACE 的方法。该试剂盒优点在于可以构建全长cDNA,无需接头连接，灵敏度强，方法简单。问：SMART技术可以用来做cDNA 末端快速扩增吗（RACE）?答：可以。随着新的SMART RACE cDNA Amplification Kit 的进一步完善，SMART 技术的所有优点都可以用在RACE 方案中。问：为什么在SMART cDNA Synthesis 过程中对PCR 循环数有一定限制？答：SMART cDNA 技术的独特点之一就是长距离PCR 扩增步骤。为了保持SMART cDNA 的基因代表性，进行尽量少的循环数量是很必要的。如果循环数过高，扩增超过指数增长阶段时，就会出现ssDNA 的积累，不适合进行cDNA 后期操作如克隆或者差减。此外，循环数越高，热稳定聚合酶出错的几率就越高，PCR 的保真度相应就会降低。因此，为了获得高质量的cDNA，稳定循环数在认可的参数之内是非常重要的。问：SMARTTM文库的特点有哪些？答：SMART cDNA 文库富集了全长的cDNA。插入片段的平均大小是1.5-2 Kb。我们曾经从SMART 文库中克隆到的最大插入片段是大于6kb 的β-肌球蛋白cDNA。即使起初材料用的是总RNA，也几乎不会筛选到核糖体RNA。实验结果表明，来自于SMART cDNA 文库的50 个克隆分析表明没有核糖体RNA 克隆。以50 ng 总RNA 或者25 ng poly A+ RNA 构建的SMART cDNA 文库的基因保真度，与用标准的Gubler and Hoffman 方法以5 ug poly A+ RNA 构建的文库相似。问：为什么SMARTTM PCR 扩增得到的cDNA 没有rRNA 序列？答：虽然在SMART 第一链cDNA 合成过程中rRNA 可以被反转录，但这些序列在接下来的PCR过程中不会被扩增。这是因为多数情况下，rRNA 序列是通过自身引导来反转录的，所以最终得到的cDNA 片段不具备5'和3'SMART 特异性序列，不能够进行指数PCR 扩增。问：可以用作SMART PCR cDNA 扩增模板所需的RNA 的最少量是多少？答：虽然我们用SMART 技术可以从10ng 的总RNA 中构建文库，但我们推荐原始材料最少是50ng 总RNA 或者25ng poly A + RNA。从而保证SMART cDNA 群质量更高，基因代表性更强。问：我可以改变SMARTTM寡苷酸序列吗？答：任何一种寡苷酸序列的改变都会影响cDNA 合成和扩增的效率。SMARTⅡ和SMART Ⅳ寡苷酸的序列和设计都是受专利保护的。购买仪器、试剂和耗材——就在易生物！展开