2021-07-29RNA制备怎样才能万无一失

众所周知，RNA是一种相当不稳定的分子，它在这一方面可比DNA差远了。我们大家在实验室里基本上都耳闻目睹过，处理这种核酸时发生的悲惨故事。幸运的是，随着RNA研究逐渐成为主流，可供选择的商业化工具也越来越丰富越来越成熟。
RNA制备过程中究竟有哪些问题需要注意，又有哪些工具可以助我们一臂之力呢，且听下文分解。
RNA制备的四大祸害碱性条件、金属离子和高温都会促使RNA分子水解。因此，RNA操作一般在0°C-4°C的中性或微酸性缓冲液中进行，人们也常常在其中添加螯合剂，比如0.1mMEDTA。有些应用不允许EDTA的存在，这时可以通过离子交换树脂来去除阳离子。
在制备RNA时，RNase一直是个令人头疼的大问题，因为这种酶基本上无处不在。生物样品本来就含有RNase，它们存在于细胞的小隔间里，当细胞被裂解时这些RNase就释放出来。另外，实验室操作也很容易引入RNase。“这种酶到处都是，我们皮肤细胞上就有。如果你戴着手套接触了脸或者手臂，也会沾到一些RNase，”Promega公司的产品经理EricVincent提醒道。
在收获组织或细胞时，“提取RNA要越快越好，或者就想办法令RNase失活，”NEB公司的RNA研究带头人BretRobb指出。
如果不能立刻提取RNA，就应当通过速冻来稳定样本，或者将样本储存在特殊的RNA保存液中，比如AllProtectTissueReagent、RNAlater。此外，PreAnalytiX公司的PAXgeneBloodRNATube也很适合保存这样的样本，“不仅能确保RNA的安全，而且让细胞不会因为温度或缓冲液条件的改变表达任何转录本，”Qiagen公司的MartinSchlumpberger介绍道。PreAnalytiX是BD和QIAGEN的一个合资公司。
绝大多数RNA分离试剂盒中的裂解缓冲液（例如Qiagen公司的RNAEasy），“可以失活任何样本所带的RNAse，”Schlumpberger解释道。“这些产品对于RNA来说是相当安全的。”如果你更喜欢自己DIY，那么异硫氰酸胍、酚/氯仿和SDS都能帮你保护样本中的RNA。
据介绍，RNA纯化之后对环境中的RNAse最为敏感，这个时候需要特别注意预防RNAse的污染。
可不可以做到万无一失如何才能保证RNA实验的成功，这已经是一个老生常谈的问题了。RNA操作时应该戴上一次性手套，并且在专门的空间里进行，尤其要与质粒制备和细菌操作分开。操作者尽量不要接触洁净度不能令人百分百放心的物品。
我们来看看NEB公司是如何做到万无一失的。NEB公司的RNA实验室统一使用RNA专用的一次性耗材。他们认为高压灭菌会使溶液中的微生物释放出RNase，而这些RNase会在灭菌之后复性。因此NEB公司只信任经过认证的无RNAse器皿，抛弃了高压灭菌过程。Robb介绍道，目前市面上有许多经过认证的RNA专用产品（试剂盒、试剂和耗材），进行RNA实验已经比十几年前容易得多了。
“过去人们在配制溶液的时候总是胆战心惊，恨不得屏住呼吸进行称量和搅拌，以免把RNase带到样本中去，”他解释道。而现在，你可以很方面的买到各种无RNAse的试剂，从水、1MTris到5MNaCl。“使用这些试剂可以为RNA实验提供额外的保障。”
许多无核酶的塑料产品都经过了第三方的检测和认证，MoBioLaboratories就提供这样的服务。“我们可以帮助制造商建立始终如一的无污染生产线，”培训操作者如何识别和消除污染源，MoBio公司的CarlTsang介绍道。
我国大多数实验室还是使用玻璃器皿，这些器皿至少需要在180°C的条件下烘烤几个小时，才能确保将RNAse永久性地摧毁。之后，研究者们可以通过商业化的试剂盒进行RNAse检测，比如NEB公司的RNAse污染分析试剂盒。
添加剂的使用DEPC（Diethylpyrocarbonate）一直被用于处理水和溶液，失活其中的RNAse。“多余的DEPC可以在高压锅中去除，因为DEPC在高温下很不稳定，会释放出CO2然后消失，”Schlumpberger说。不过许多人并不爱和这种可能致癌的化合物打交道，Schlumpberger强调，如果没有正确处理，残余的DEPC也会使RNA失活。
对于那些不能高压灭菌的器物，我们可以用RNaseAway试剂处理，然而将其浸泡在无RNAse的水里。
Vincent指出，RNAse抑制剂的使用应当成为常规。以Promega公司的RNAsin为例，RNAse抑制剂能够特异性结合并抑制实验室中常见的RNAse，包括RNAseA、B、C和人胎盘RNAse。“等你发现引入了RNAse时往往已经太迟了，多加一层保险是很有必要的，”他说。
只要我们了解威胁RNA的主要因素（高pH、高温、金属离子和内切酶），就能够想办法一一化解。这时你会发现，RNA制备其实并没有那么难。
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