1）用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取纯化组织和细胞中的RNA

1.选取从组织细胞或细胞中提取RNA的适宜方法

组织

a.分离组织并立即置于液氮中。

b.将约100mg冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

c.将组织碎末移入含3ml溶液D的管中。

D溶液（变性液）

4mol/L硫氰酸胍

25mmol/L柠檬酸钠·2H₂O

0.5%（m/V）月桂基磺酸钠

0.1mol/Lβ-巯基乙醇

将250g硫氰酸胍、0.75mol/L（pH7.0）柠檬酸钠17.6ml和26.4mol10%(m/V)月桂基磺酸钠于293ml水中。加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀，直至完全溶解。室温贮存溶液D，每次临用前加入14.4mol/L的β-巯基乙醇，每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。注意胍基盐在低温下易沉淀。

d.用搅拌子室温下搅拌组织15~30s。

哺乳动物悬浮细胞

a.室温下200~1900g离心5~10min（1000~3000r/min用SorvallRT600,H1000转子）收获细胞。

b.吸出培养基将细胞重悬于1~2ml冰预冷的PBS中。

c.离心收获细胞，彻底吸尽PBS，每10⁶细胞加2ml溶液D。

d.用搅拌子室温下搅拌细胞15~30s。

哺乳动物单层培养细胞

a.吸出培养基用5~10ml冰冷的PBS洗细胞一次。

b.吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90mm培养皿加2ml（60mm培养皿加1ml）。

c.将细胞溶解物移至管中。

d.用搅拌子室温下搅拌溶解细胞15~30s。

2.将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1ml2mol/L的醋酸钠（pH4.0），1ml酚，0.2ml氯仿-异戊醇。加入每组组分后，盖上管盖，倒置混匀。

3.将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。

4.10000g（9000r/min用SorvallSS-34转子）4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。

5.加入于提取的RNA等量的异丙醇。充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA1h或更长时间。

6.10000g(9000r/min用SorvallSS-34转子)4℃离心30min，收集沉淀的RNA。

7.轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1ml第一步所使用的溶液加0.3ml溶液D。

8.将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA1h或更长时间。

9.在微量离心机上，于4℃最大速离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。

10.加50～100μlDEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。

11.估计RNA的浓度。

2）根据大小分离RNA：乙二醛化RNA的琼脂凝胶电泳

1.配制乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：

RNA（总共10μg）1～2μl

乙二醛反应混合液10μl

2.盖上离心管的盖子，将RNA溶液在55℃放置60min，在冰水中冰浴10min，然后离心5s，使所有液体沉到离心管底部。

3.在样品加热过程中，将琼脂凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的1×BPTE电泳缓冲液，使其没过凝胶约1mmol/L。

4.将1～2μlRNA上样缓冲液加到乙二醛化的RNA样品中，然后马上把RNA样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将RNA相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。

5.以5V/cm的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约8cm。

6.将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察RNA。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。

7.在照片上量出从加样孔到各RNA条带的距离。以RNA片段大小的对数（log₁₀）值对迁移的距离作图。用得到的曲线计算点杂交检测到的RNA的大小。

8．用上行或下行毛细管转移法把RNA固定在固体支持物上。

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