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RTPCR经验浅谈
做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增,设计方案是将全基因组分成7个片段,0.6kb-3.3kb不等,分别进行RT-PCR扩增,刚开始的三个月,我们课题组三个人辛辛苦苦,什么招都想过了,结果连一个片段都没有拿到。后来有一个周末,我一个人安安静静做了一天,PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月:一下子隐隐约约出了3个片段!!!紧接着把胶里的弱带切下,水溶并后做二次扩增(注:跑胶总会吧,在UV下,参照Marker,将特异性高,且与预期大小相同的DNA带切出,放在一个ep管里,加入适量无菌水,用枪头将胶反复搅碎,高速离心,小心吸取2ul上清用作模板,进行第二次PCR扩增)很快,三个预期的片段都得到了理想的扩增。不到一个月,12kb的全基因组各片段全部收归囊下。我这次成功的关键在于:提取RNA时,收集沉淀这一步。离心速度不要低于13000rpm(r=5cm),提高离心速度、延长离心时间,在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行,这些时我本人总结出来的经验。在后来的实验中,几乎每次RT-PCR都非常顺利,除了材料本身就没有目标基因。这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题,在一般的逆转录反应中,较常用的是MMLV(鼠源的)和AMV(禽源的)两种,现在更有各家公司推出的耐热的(50-60度)、超长片段的逆转录酶,这方面具有专长的数Gibco(现在并购于Invitrogen)。我们实验室使用的一般是MMLV,鼠源的酶,虽然活性比较低一点,但是对应的RNaseH活性也很低,在长时间的逆转录过程中,不会造成模板的降解,获得CDNA的几率大,适用于较长的cDNA链的合成。对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。但是AMV也有其自身的优点,酶的活性很高,扩增1kb以下的基因时比较常用,我知道临床上血液检测中有时使用AMV,省时,也省试剂。另外,MMLV逆转录反应的条件比较好掌握,反应液的组分简单,AMV的反应液有的需要添加焦磷酸钠(这种试剂不好找到)。反应温度最好每次都控制不变,MMLV我每次都使用37度,虽然mannual上说使用特异性引物可以升到42度进行逆转录反应,但是有一次42度没有扩增结果,改为37度却扩出了所需要的带(使用的20mer特异性引物),从此以后我一直使用37度,后来的结果也还可以。长片段逆转录,比如某些RNA病毒的全基因组RT-PCR扩增,10kb左右,可以选用上面提到的耐热、RNaseH-的逆转录酶,可能比较贵一点,但是很多文献报到能够得到很好的扩增,本人尝试过,说实话,可能没有太认真去优化条件,很遗憾连设计的6kb都没有得到扩增产物。由此,我建议大家不要轻易尝试这个方法,一则扩增的难度确实存在,另外,扩增的忠实性不能得到很好的保证。不同的实验目的也不一样,一下子得到这样长的片段,后续的改造也很困难。还有一个需要指出的问题是,有些同行喜欢一下子提很多RNA,加保护剂如RNaseinhibiter等,冻存,以后长期使用,我不推荐这样做。RNA在低量存在时非常容易降解,任何保存方法都比不上不保存^_^,我的做法是马上做RT,不吃饭也要做上去,为了省去日后不尽的麻烦,切记切记!
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