CRISPR/Cas9/基因编辑/sgRNA/慢病毒/LV/LV包装

一、CRISPR/Cas9技术：

CRISPR/Cas系统最早是在细菌的获得性免疫系统中发现的。规律性重复短回文序列簇(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPRs)是一类独特的DNA规律性重复序列，存在于大多数的细菌和古细菌中。

通常在临近CRISPR的区域还包含一组保守的蛋白质编码基因，被称为Cas（CRISPR-associated）基因，其编码的蛋白质包括核酸酶、聚合酶、解旋酶，具有与核糖核酸结合的功能。

这些Cas蛋白与CRISPR转录出的RNA结合形成核糖核蛋白复合物，在原核生物中发挥着获得性免疫功能，使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。

一般来说，当外源DNA片段入侵后，宿主会捕获一段20bp左右的DNA片段（被称为protospacer），将其插入到自身的基因组中，形成CRISPR区域，在TypeIICRISPR-Cas系统中，主要由Cas9蛋白、反式激活crRNA（trans-activatingcrRNA,tracrRNA）和CRISPR-derivedRNA（crRNA）组成。

CRISPR区域首先转录成前体RNA（pre-crRNA），在Cas9蛋白的参与下加工成一段含保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，同时，tracrRNA也会被转录并和crRNA形成一种双链的RNA结构，然后与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的复合物。该复合物在crRNA的引导下，由Cas9蛋白的核酸结构域对外源DNA进行切割。

其中，tracrRNA结合DNA序列的位置是protospacer和PAM（protospacer-adjacentmotif）序列，CRISPR/Cas9系统的切割位点依赖于crRNA互补序列下游的PAM序列，该序列对于靶位点的识别和切割是必需的，在每4~8bp的随机DNA序列中就重复出现一次，因此对于靶位点的设计还是相对容易的。

研究发现，将pre-crRNA和tracrRNA构建成一个融合RNA（single-guideRNA,sgRNA）来模拟成熟的crRNA和tracrRNA，导入细胞后同样可以与Cas9蛋白共同作用特异地切割目的DNA，从而将CRISPR/Cas9系统简化成Cas9蛋白和sgRNA两个组分，来实现对特定靶向位点的切割。

二、CRISPR/Cas9技术的操作步骤：

通过人工设计tracrRNA/crRNA，可以改造成具有引导作用的sgRNA，以引导cas9对DNA的定点切割，造成DNA双链的断裂，然后细胞可以利用NHEJ或者同源重组的方式实现基因敲除或对基因精确编辑的目的，CRISPR/Cas9技术的应用主要包括以下几个关键步骤：

1、靶基因分析：根据靶基因的名称和种属信息，在NCBI、EnsemblGenomes或其他分子生物学网站上进行查找，搜索到该基因的信息，并明确CDS外显子部分；

2、sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。选择好要设计的区域后，再通过预测网站进行序列预测。序列预测的目的主要是避免Cas9脱靶效应，以确保设计的sgRNA尽可能的减少脱靶效应；

3、CRISPR/Cas9载体构建：根据sgRNA序列，安排引物合成。引物合成时，需要在引物的5’端引入粘性末端。将引物退火形成带粘性末端的双链片段，取1ul用于后续的连接反应，其余在-20℃下保存。对表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定；

4、CRISPR/Cas9载体活性检测：对于构建的Cas9载体，转染细胞进行重组效率的检测，检测的方法主要是采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，这一方法可以特异、定量的检测基因组重组效率。

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